Keletas revoliucinių išradimų aptikimo technologijos istorijoje, mano galva, yra imuninio ženklinimo technologija, pagrįsta specifinio antigeno-antikūno surišimo principu, PGR technologija ir sekos nustatymo technologija.Šiandien kalbėsime apie PGR technologiją.Atsižvelgdami į PGR technologijos raidą, žmonės paprastai skirsto PGR technologiją į tris kartas: įprastą PGR technologiją, realaus laiko fluorescencinę kiekybinę PGR technologiją ir skaitmeninę PGR technologiją.
CĮprasta PGR technika
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis išrado polimerazės grandininę reakciją (polimerazės grandininę reakciją, PGR) 1983 m. Teigiama, kad vairuodamas savo merginą jam staiga užplūdo įkvėpimas ir pagalvojo apie PGR principą (apie vairavimo naudą).1993 m. Kary Mullis buvo apdovanotas Nobelio chemijos premija. „The New York Times“ komentavo: „Labai originalus ir reikšmingas, beveik suskirstantis biologiją į eras iki PGR ir po PGR.
PGR principas: Katalizuojant DNR polimerazei, pagrindinės grandinės DNR naudojama kaip šablonas, o specifinis pradmuo naudojamas kaip pradinis pratęsimo taškas, o dukterinė DNR grandinė, kuri papildo motininės grandinės šablono DNR, yra kopijuojama in vitro per denatūravimą, atkaitinimą, pratęsimą ir kitus veiksmus.Tai DNR sintezės amplifikacijos in vitro technologija, kuri gali greitai ir specifiškai amplifikuoti bet kokią tikslinę DNR in vitro.
Įprasto PGR privalumai
1.Klasikinis metodas, pilni tarptautiniai ir vietiniai standartai
2.Mažesnė instrumentinių reagentų kaina
3.PGR produktus galima atkurti kitiems molekulinės biologijos eksperimentams
Rekomenduojamas Foregene PGR aparatas: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Susiję produktai: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Įprasto PGR trūkumai
1.lengva užteršti
2.sudėtinga operacija
3.tik kokybinė analizė
4.Vidutinis jautrumas
5.Yra nespecifinis stiprinimas, o kai nespecifinė juosta yra tokio pat dydžio kaip tikslinė juosta, jos negalima atskirti
Capiliarinė elektroforezė pagrįsta PGR
Reaguodami į įprastos PGR trūkumus, kai kurie gamintojai pristatė instrumentus, pagrįstus kapiliarinės elektroforezės principu.Elektroforezės etapas po PGR amplifikacijos baigiamas kapiliare.Jautrumas didesnis, o kelių bazių skirtumą galima išskirti ir stiprinimą apskaičiuoti MAERKER.produkto turinys.Trūkumas yra tas, kad PGR produktą vis tiek reikia atidaryti ir įdėti į prietaisą, ir vis tiek išlieka didelė užteršimo rizika.
CapiliarasEelektroforezė
2. Realaus laiko fluorescencinė kiekybinė PGR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) technologijaFluorescencinė kiekybinė PGR, dar vadinama realaus laiko PGR, yra nauja nukleino rūgščių kiekybinė technologija, kurią 1995 m. sukūrė PE (Perkin Elmer). Fluorescencinės kiekybinės PGR raidos istorija yra sielą sujaudinančių milžinų, tokių kaip ABI, Roche ir Bio-Rad, kovų istorija.Jei susidomėjote, galite tai patikrinti.Šis metodas šiuo metu yra labiausiai subrendęs ir plačiausiai naudojamas pusiau kiekybinis PGR metodas.
Rekomenduojamas qPCR įrenginys: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorescencinių dažų metodas (SYBR Green I):SYBR Green I yra dažniausiai naudojamas DNR surišantis dažiklis kiekybinei PGR, kuris nespecifiškai jungiasi su dvigrande DNR.Laisvoje būsenoje SYBR Green skleidžia silpną fluorescenciją, tačiau susijungus su dvigrande DNR, jos fluorescencija padidėja 1000 kartų.Todėl bendras reakcijos skleidžiamas fluorescencinis signalas yra proporcingas esamos dvigrandės DNR kiekiui ir padidės didėjant amplifikuoto produkto kiekiui.Kadangi dažai nespecifiškai jungiasi su dviguba DNR, gali būti gauti klaidingai teigiami rezultatai.
Susiję produktai: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescencinio zondo metodas (Taqman technologija): PerPGR amplifikacija, specifinis fluorescencinis zondas pridedamas tuo pačiu metu kaip pradmenų pora.Zondas yra linijinis oligonukleotidas, kurio abiejuose galuose atitinkamai pažymėta fluorescencinė reporterio grupė ir fluorescencinė gesinimo grupė.Kai zondas nepažeistas, reporterių grupės skleidžiamą fluorescencinį signalą sugeria gesinimo grupė, o aptikimas Fluorescencinio signalo nėra;PGR amplifikacijos metu (prailginimo stadijoje) Taq fermento 5'-3' Dicer aktyvumas virškins ir suardys zondą, todėl reporterio fluorescencinė grupė ir gesinimo fluorescencinė grupė bus atskirtos, kad būtų galima gauti fluorescencijos stebėjimo sistemą Fluorescencinis signalas gali būti priimtas, tai yra kiekvieną kartą, kai susidaro DNR grandinė, o sinchronizacija užbaigiama sinchronizacija. fluorescencinių signalų ir PGR produktų susidarymo.Taqman zondo metodas yra dažniausiai naudojamas aptikimo metodas klinikinėje aptikoje.
Susiję produktai: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR privalumai
1.Metodas yra brandus, o pagalbinė įranga ir reagentai yra baigti
2.Vidutinė reagentų kaina
3.paprasta naudoti
4.Didelis aptikimo jautrumas ir specifiškumas
qPCR trūkumai
Dėl tikslinio geno mutacijos nepavyksta aptikti.
Neįmanoma nustatyti mažos koncentracijos šablono aptikimo rezultato.
Naudojant standartinę kiekybinio aptikimo kreivę, yra didelė klaida.
3. Skaitmeninė PGR (skaitmeninė PCR, dPCR) technologija
Skaitmeninis PGR yra absoliutaus nukleorūgščių molekulių kiekybinio nustatymo technika.Palyginti su qPCR, skaitmeninis PGR gali tiesiogiai nuskaityti DNR / RNR molekulių skaičių, o tai yra absoliutus nukleorūgščių molekulių kiekis pradiniame mėginyje.1999 m. Bertas Vogelsteinas ir Kennethas W. Kin-zleris oficialiai pasiūlė dPCR koncepciją.
2006 m. „Fluidigm“ pirmoji pagamino komercinę lusto pagrindu veikiančią dPCR priemonę.2009 m. Life Technologies pristatė OpenArray ir QuantStudio 12K Flex dPCR sistemas.2013 m. „Life Technologies“ pristatė „QuantStudio 3DdPCR“ sistemą, kuri naudoja didelio tankio nanoskalės mikrofluidinių lustų technologiją, kad mėginiai būtų tolygiai paskirstyti 20 000 atskirų ląstelių.reakcijos šulinyje.
2011 m. „Bio-Rad“ pristatė lašelių pagrindu sukurtą QX100 dPCR prietaisą, kuris naudoja vandens aliejuje technologiją, kad mėginys tolygiai paskirstytų 20 000 lašelių vandens aliejuje, o lašeliams analizuoti naudojamas lašelių analizatorius.2012 m. „RainDance“ pristatė „RainDrop dPCR“ instrumentą, varomą aukšto slėgio dujomis, kad kiekviena standartinė reakcijos sistema būtų padalinta į reakcijos emulsiją, kurioje yra nuo 1 milijono iki 10 milijonų pikolitrų lygio mikrolašelių.
Iki šiol skaitmeninis PGR sudarė dvi pagrindines frakcijas: lusto tipą ir lašelių tipą.Nesvarbu, koks skaitmeninis PGR, jo pagrindiniai principai yra skiedimo ribojimas, galutinio taško PGR ir Puasono paskirstymas.Standartinė PGR reakcijos sistema, kurioje yra nukleorūgščių šablonų, yra tolygiai suskirstyta į dešimtis tūkstančių PGR reakcijų, kurios paskirstomos į lustus arba mikrolašelius, kad kiekvienoje reakcijoje būtų kuo daugiau šabloninės molekulės, o būtų atliekama vienos molekulės šabloninė PGR reakcija.Skaitant fluorescenciją Skaičiuojamas signalo buvimas ar nebuvimas, o absoliutus kiekybinis įvertinimas atliekamas po statistinio Puasono pasiskirstymo kalibravimo.
Toliau pateikiamos kelių mano naudotų skaitmeninių PGR platformų charakteristikos:
1. Bio-Rad QX200 lašelinis skaitmeninis PGR Bio-RadQX200 yra labai klasikinė skaitmeninė PGR platforma, pagrindinis aptikimo procesas: 20 000 mėginių generuojama lašelių generatoriumi Vanduo aliejuje mikrolašeliai sustiprinami įprastu PGR aparatu, galiausiai kiekvieno mikrolašelio fluorescencinis signalas nuskaitomas mikrolašelių skaitytuvu.Operacija yra sudėtingesnė, o taršos rizika yra vidutinė.
Xinyi TD1 mikrolašelių skaitmeninis PGRXinyi TD1 yra buitinė skaitmeninė PGR platforma, pagrindinis aptikimo procesas: generuoja 30 000–50 000 vandens aliejuje lašelių per lašelių generatorių, sustiprina įprastu PGR prietaisu ir galiausiai perduoda Lašelių skaitytuvas nuskaito kiekvieno lašelio fluorescencinį signalą.Tiek lašelių generavimas, tiek skaitymas šioje platformoje atliekami tam skirtame mikroschemoje su maža užteršimo rizika.
STILLA Naica mikro-lašelių lusto skaitmeninis PGRSTILLA Naica yra palyginti nauja skaitmeninė PGR platforma.Pagrindinis aptikimo procesas yra toks: į lustą įpilkite reakcijos tirpalo, įdėkite lustą į mikrolašelių generavimo ir stiprinimo sistemą ir sugeneruokite 30 000 mikrolašelių.Paskleiskite ant lusto, o PGR amplifikacija bus baigta ant lusto.Tada sustiprintas lustas perkeliamas į mikrolašelių skaitymo analizės sistemą, o fluorescencinis signalas nuskaitomas darant nuotraukas.Kadangi visas procesas vyksta uždaroje lustoje, užteršimo rizika yra maža.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D lusto skaitmeninis PGR
„ThermoFisher QuantStudio 3D“ yra dar viena klasikinė lustais pagrįsta skaitmeninė PGR platforma.Pagrindinis jo aptikimo procesas yra toks: supilkite reakcijos tirpalą į barstytuvą ir tolygiai paskleiskite reakcijos tirpalą ant lusto su 20 000 mikrošulinėlių per barstytuvą., įdėkite lustą į PGR aparatą, kad sustiprintumėte, ir galiausiai įdėkite lustą į skaitytuvą ir nufotografuokite, kad nuskaitytumėte fluorescencinį signalą.Operacija yra gana sudėtinga, o visas procesas vyksta uždaroje lustoje, o užteršimo rizika yra maža.
5. JN MEDSYS Clarity chip skaitmeninis PGR
JN MEDSYS Clarity yra palyginti nauja lusto tipo skaitmeninė PGR platforma.Jo pagrindinis aptikimo procesas yra toks: įpilkite reakcijos tirpalo į aplikatorių ir tolygiai paskleiskite reakcijos tirpalą ant 10 000 PGR mėgintuvėlių, pritvirtintų PGR mėgintuvėlyje per aplikatorių.Mikroporinėje mikroschemoje reakcijos tirpalas kapiliariniu būdu patenka į lustą, o PGR vamzdelis su mikroschema dedamas ant PGR aparato amplifikacijai, o galiausiai lustas įdedamas į skaitytuvą, kad nuskaitytų fluorescencinį signalą fotografuojant.Operacija yra sudėtingesnė.Užteršimo rizika yra maža.
Kiekvienos skaitmeninės PGR platformos parametrai apibendrinti taip:
Skaitmeninės PGR platformos vertinimo rodikliai yra šie: padalintų vienetų skaičius, fluorescencinių kanalų skaičius, veikimo sudėtingumas ir užteršimo rizika.Tačiau svarbiausias dalykas yra aptikimo tikslumas.Vienas iš būdų įvertinti skaitmenines PGR platformas yra naudoti kelias skaitmenines PGR platformas, kad būtų galima patikrinti viena kitą, o kitas būdas – naudoti standartines medžiagas su tiksliomis vertėmis.
dPCR privalumai
1.Absoliutaus kiekybinio įvertinimo pasiekimas
2.Didesnis jautrumas ir specifiškumas
3.Gali aptikti mažai kopijų pavyzdžius
dPCR trūkumai1. Brangi įranga ir reagentai 2. Sudėtingas veikimas ir ilgas aptikimo laikas 3. Siauras aptikimo diapazonas
Šiuo metu trys PGR technologijos kartos turi savų privalumų ir trūkumų, kiekviena iš jų turi savo taikymo sritis, ir tai nėra ryšys, kad viena karta pakeičia kitą.Nuolatinė technologijų pažanga suteikė PGR technologijai naujo gyvybingumo, leidžiančią atrakinti vieną taikymo kryptį po kitos, todėl nukleorūgščių aptikimas tapo patogesnis ir tikslesnis.
Šaltinis: daktaras Yuanas nuveža jus testuoti
Rekomenduojami produktai:
Paskelbimo laikas: 2022-11-18
