Pradinė medžiaga: RNR
Kiekybinė atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-qPCR) yra eksperimentinis metodas, naudojamas PGR eksperimentuose naudojant RNR kaip pradinę medžiagą.Taikant šį metodą, visa RNR arba pasiuntinio RNR (mRNR) atvirkštine transkriptaze pirmiausia transkribuojama į komplementarią DNR (cDNR).Vėliau buvo atlikta qPCR reakcija, naudojant cDNR kaip šabloną.RT-qPCR buvo naudojamas įvairiose molekulinės biologijos programose, įskaitant genų ekspresijos analizę, RNR trukdžių patvirtinimą, mikrogardelių patvirtinimą, patogenų aptikimą, genetinius tyrimus ir ligų tyrimus.
Vieno etapo ir dviejų pakopų RT-qPCR metodai
RT-qPCR gali būti atliktas vieno arba dviejų pakopų metodu.Vieno etapo RT-qPCR apjungia atvirkštinę transkripciją ir PGR amplifikaciją, leidžiančią atvirkštinei transkriptazei ir DNR polimerazei užbaigti reakciją tame pačiame mėgintuvėlyje tomis pačiomis buferio sąlygomis.Vieno etapo RT-qPCR reikalauja naudoti tik sekos specifinius pradmenis.Dviejų pakopų RT-qPCR atvirkštinė transkripcija ir PGR amplifikacija atliekami dviejuose mėgintuvėliuose, naudojant skirtingus optimizuotus buferius, reakcijos sąlygas ir pradmenų projektavimo strategijas.
| Privalumas | Trūkumas | |
| Vienas žingsnis | Šis metodas turi mažiau eksperimentinių klaidų, nes abi reakcijos atliekamos viename mėgintuvėlyje
Mažiau pipetavimo etapų sumažina užteršimo riziką
Tinka didelio našumo stiprinimui/atrankai, greitas ir atkuriamas | Dviejų pakopų reakcijos negali būti optimizuojamos atskirai
Kadangi reakcijos sąlygos pažeidžiamos derinant dviejų pakopų reakciją, jautrumas nėra toks geras kaip dviejų pakopų metodo
Vieno mėginio aptiktų taikinių skaičius yra mažas |
| Du žingsniai | Galimybė sukurti stabilias cDNR bibliotekas, kurios gali būti saugomos ilgą laiką ir naudojamos keliose reakcijose
Tiksliniai genai ir etaloniniai genai gali būti amplifikuojami iš tos pačios cDNR bibliotekos, nereikia kelių cDNR bibliotekų
Reakcijos buferiai ir reakcijos sąlygos, leidžiančios optimizuoti atskiras reakcijas
Lankstus paleidimo sąlygų pasirinkimas | Naudojant kelis mėgintuvėlius ir daugiau pipetavimo etapų, padidėja DNR užteršimo rizika, ir daug laiko.
Reikia daugiau optimizavimo nei vieno žingsnio metodas |
Susiję produktai:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (vienas žingsnis)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master premiksas pirmosios krypties CDNA sintezei
Realaus laiko PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I rinkinys
Realaus laiko PCR Easyᵀᴹ-Taqman
Suminės RNR ir mRNR parinkimas
Kuriant RT-qPCR eksperimentą, svarbu nuspręsti, ar naudoti bendrą RNR ar išgrynintą mRNR kaip atvirkštinės transkripcijos šabloną.Nors mRNR gali užtikrinti šiek tiek didesnį jautrumą, bendra RNR vis dar dažnai naudojama.To priežastis yra ta, kad bendra RNR turi svarbesnį pradinės medžiagos pranašumą nei mRNR.Pirma, procesas reikalauja mažiau gryninimo etapų, o tai užtikrina geresnį kiekybinį šablono atkūrimą ir geresnį rezultatų normalizavimą pagal pradinį ląstelių skaičių.Antra, išvengiama mRNR sodrinimo žingsnio, kuris gali išvengti iškreiptų rezultatų dėl skirtingo skirtingų mRNR atkūrimo.Apskritai, kadangi daugeliu atvejų santykinis tikslinio geno kiekybinis nustatymas yra svarbesnis nei absoliutus aptikimo jautrumas, daugeliu atvejų bendroji RNR yra tinkamesnė.
Atvirkštinės transkripcijos pradmenys
Taikant dviejų pakopų metodą, cDNR reakcijai pradėti gali būti naudojami trys skirtingi metodai: oligo(dT) pradmenys, atsitiktiniai pradmenys arba sekos specifiniai pradmenys.Paprastai oligo(dT) pradmenys ir atsitiktiniai pradmenys naudojami kartu.Šie pradmenys prisijungia prie šabloninės mRNR grandinės ir suteikia atvirkštinę transkriptazę su pradiniu tašku sintezei.
| Grunto pasirinkimas | Struktūra ir funkcija | Privalumas | Trūkumas |
| Oligo(dT) gruntas (arba įtvirtintas oligo(dT) gruntas) | Išplėstas atkaitinimas prie timino liekanų mRNR poli(A) uodegoje;inkaro oligo (dT) pradmuo turi G, C arba A 3′ gale (inkaro vieta) | Viso ilgio cDNR sintezė iš poli(A) uodegos mRNR
Taikoma, kai yra mažiau pradinės medžiagos
Tvirtinimo vieta užtikrina, kad oligo(dT) pradmuo prisijungtų prie mRNR 5′ poli(A) uodegos | Tinka tik amplifikuoti genus su poli(A) uodega
Gaukite cDNR, sutrumpintą iš pradinės vietos*2 poli(A)
Pakeistas susieti su 3′ galu*
*Ši galimybė yra sumažinta, jei naudojami pritvirtinti oligo(dT) pradmenys |
| atsitiktinis gruntas
| 6–9 bazių ilgio, kurios gali susijungti su keliomis vietomis RNR transkripcijos metu | Prisijungimas prie visų RNR (tRNR, rRNR ir mRNR)
Tinka nuorašams, turintiems reikšmingą antrinę struktūrą arba kai yra mažiau pradinės medžiagos
Didelė cDNR išeiga | cDNR yra atvirkštinė transkribuojama iš visos RNR, o tai paprastai nėra pageidautina ir gali atskiesti tikslinės mRNR signalą
gauti sutrumpintą cDNR |
| sekos specifiniai pradmenys | Individualūs pradmenys, nukreipti į konkrečias mRNR sekas | specifinė cDNR biblioteka
Pagerinti jautrumą
Naudojant atvirkštinius qPCR pradmenis | Apsiribojama tik vieno tikslinio geno sinteze |
Atvirkštinė transkriptazė
Atvirkštinė transkriptazė yra fermentas, kuris naudoja RNR DNR sintezei.Kai kurios atvirkštinės transkriptazės turi Rnazės aktyvumą ir po transkripcijos gali suardyti RNR grandines RNR-DNR hibridinėse grandinėse.Jei jis neturi RNazės fermentinio aktyvumo, RNaseH gali būti pridėtas siekiant didesnio qPCR efektyvumo.Dažniausiai naudojami fermentai yra Moloney pelių leukemijos viruso atvirkštinė transkriptazė ir paukščių mieloblastomos viruso atvirkštinė transkriptazė.RT-qPCR idealiai tinka pasirinkti atvirkštinę transkriptazę su didesniu termostabilumu, kad cDNR sintezė būtų vykdoma aukštesnėje temperatūroje, užtikrinant sėkmingą aukštesnės antrinės struktūros RNR transkripciją, išlaikant visą jų aktyvumą visos reakcijos metu, todėl cDNR išeiga yra didesnė.
Susiję produktai:
Foreasy M-MLV atvirkštinė transkriptazė
Atvirkštinės transkriptazės RNazės H aktyvumas
RNaseH gali skaidyti RNR grandines iš RNR-DNR dupleksų, todėl efektyviai sintezuojama dvigrandė DNR.Tačiau naudojant ilgą mRNR kaip šabloną, RNR gali būti per anksti suardyta, todėl cDNR bus sutrumpinta.Todėl dažnai naudinga sumažinti RNaseH aktyvumą cDNR klonavimo metu, jei norima ilgų transkriptų sintezės.Priešingai, atvirkštinės transkriptazės, turinčios RNazės H aktyvumą, dažnai yra naudingos naudojant qPCR, nes jos pagerina RNR-DNR dupleksų tirpimą pirmojo PGR ciklo metu.
Grunto dizainas
PGR pradmenys, naudojami qPCR etapui RT-qPCR, idealiai turėtų būti suprojektuoti taip, kad apimtų egzono ir egzono jungtį, kur amplifikacijos pradmenys galėtų apimti tikrąją egzono ir introno ribą.Kadangi intronų turinčios genominės DNR sekos nėra amplifikuojamos, šis dizainas sumažina klaidingų teigiamų rezultatų, amplifikuotų užterštos genominės DNR, riziką.
Jei pradmenys negali būti suprojektuoti taip, kad atskirtų egzonus arba egzonų ir egzonų ribas, gali prireikti RNR mėginius apdoroti DNaze I arba dsDNaze be RNazės, kad būtų pašalintas genomo DNR užterštumas.
RT-qPCR valdymas
Atvirkštinės transkripcijos neigiama kontrolė (-RT kontrolė) turėtų būti įtraukta į visus RT-qPCR eksperimentus, kad būtų galima nustatyti DNR užterštumą (pvz., genomo DNR arba PGR produktus iš ankstesnių reakcijų).Šioje kontrolėje yra visi reakcijos komponentai, išskyrus atvirkštinę transkriptazę.Kadangi naudojant šią kontrolę atvirkštinė transkripcija nevyksta, jei pastebima PGR amplifikacija, užteršimas iš DNR yra labiausiai tikėtinas.
Paskelbimo laikas: 2022-02-02
