• PGR yra metodas, naudojamas DNR amplifikuoti iš nedidelio DNR šablono kiekio.RT-PGR naudoja atvirkštinę transkripciją, kad gautų DNR šabloną iš RNR šaltinio, kuris vėliau gali būti amplifikuojamas.
• PGR ir RT-PGR paprastai yra galutinio taško reakcijos, o qPCR ir RT-qPCR naudoja produkto sintezės greičio kinetiką PGR reakcijos metu, kad būtų nustatytas esančio šablono kiekis.
• Naujesni metodai, tokie kaip skaitmeninis PGR, suteikia absoliučią pradinio DNR šablono kiekybinį įvertinimą, o tokie metodai kaip izoterminė PGR sumažina brangios įrangos poreikį patikimiems rezultatams gauti.

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra gana paprastas ir plačiai naudojamas molekulinės biologijos metodas, skirtas amplifikuoti ir aptikti DNR ir RNR sekas.Palyginti su tradiciniais DNR klonavimo ir amplifikavimo metodais, kurie dažnai gali užtrukti kelias dienas, PGR reikia tik kelių valandų.PGR yra labai jautrus ir reikalauja minimalaus šablono specifinėms sekoms aptikti ir amplifikuoti.Pagrindiniai PGR metodai pažengė į priekį nuo paprasto DNR ir RNR aptikimo.Žemiau pateikiame įvairių PGR metodų ir reagentų, kuriuos „Enzo Life Sciences“ tiekiame jūsų tyrimų poreikiams, apžvalgą.Siekiame padėti mokslininkams greitai gauti PGR reagentus, kuriuos jie gali naudoti kitame tyrimo projekte!

PGR

Norint atlikti standartinį PGR, jums tereikia DNR polimerazės, magnio, nukleotidų, pradmenų, amplifikuojamo DNR šablono ir termociklerio.PGR mechanizmas yra toks pat paprastas, kaip ir jo paskirtis: 1) dvigrandė DNR (dsDNR) denatūruojama termiškai, 2) pradmenys susilygina su atskiromis DNR grandinėmis ir 3) pradmenys yra pratęsiami DNR polimerazės, todėl susidaro dvi DNR kopijos. originali DNR grandinė.Denatūravimo, atkaitinimo ir pailgėjimo procesas tam tikromis temperatūrų ir laiko serijomis yra žinomas kaip vienas stiprinimo ciklas (1 pav.).

Kiekvienas ciklo žingsnis turėtų būti optimizuotas pagal naudojamą šabloną ir pradmenų rinkinį.Šis ciklas kartojamas maždaug 20–40 kartų, o amplifikuotas produktas gali būti analizuojamas, paprastai naudojant agarozės gelį (2 pav.).

Kadangi PGR yra labai jautrus metodas ir pavienėms reakcijoms reikalingi labai maži tūriai, rekomenduojama paruošti pagrindinį mišinį kelioms reakcijoms.Pagrindinis mišinys turi būti gerai sumaišytas ir padalintas pagal reakcijų skaičių, užtikrinant, kad kiekvienoje reakcijoje būtų toks pat kiekis fermentų, dNTP ir pradmenų.Daugelis tiekėjų, pavyzdžiui, Enzo Life Sciences, taip pat siūlo PGR mišinius, kuriuose jau yra visko, išskyrus pradmenis ir DNR šabloną.

Guanino / citozino turtingi (GC turtingi) regionai yra iššūkis standartiniams PGR metodams.GC turtingos sekos yra stabilesnės nei sekos su mažesniu GC kiekiu.Be to, sekos, kuriose gausu GC, dažniausiai sudaro antrines struktūras, tokias kaip plaukų segtuko kilpos.Dėl to GC turtingas dvigubas sruogas sunku visiškai atskirti denatūravimo fazės metu.Vadinasi, DNR polimerazė negali be kliūčių sintetinti naujos grandinės.Aukštesnė denatūravimo temperatūra gali tai pagerinti, o koregavimas siekiant aukštesnės atkaitinimo temperatūros ir trumpesnio atkaitinimo laiko gali užkirsti kelią nespecifiniam GC turtingų pradmenų surišimui.Papildomi reagentai gali sustiprinti GC turtingų sekų amplifikaciją.DMSO, glicerolis ir betainas padeda suardyti antrines struktūras, kurias sukelia GC sąveika, ir taip palengvina dvigubų grandžių atskyrimą.

Hot Start PCR

Nespecifinė amplifikacija yra problema, kuri gali atsirasti atliekant PGR.Dauguma DNR polimerazių, naudojamų PGR, geriausiai veikia esant maždaug 68–72 °C temperatūrai.Tačiau fermentas gali būti aktyvus ir žemesnėje temperatūroje, nors ir žemesniu laipsniu.Esant daug žemesnei nei atkaitinimo temperatūrai, pradmenys gali jungtis nespecifiškai ir sukelti nespecifinį amplifikaciją, net jei reakcija vyksta ant ledo.To galima išvengti naudojant polimerazės inhibitorius, kurie atsiskiria nuo DNR polimerazės tik pasiekus tam tikrą temperatūrą, todėl terminas karšto paleidimo PGR.Inhibitorius gali būti antikūnas, kuris suriša polimerazę ir denatūruojasi pradinėje denatūravimo temperatūroje (paprastai 95°C).

Aukštos kokybės polimerazė

Nors DNR polimerazės gana tiksliai amplifikuojasi pagal pradinę šablono seką, gali atsirasti nukleotidų derinimo klaidų.Dėl programų, pvz., klonavimo, neatitikimų gali būti sutrumpinti transkriptai ir neteisingai išversti arba neaktyvūs baltymai.Siekiant išvengti šių neatitikimų, buvo nustatytos polimerazės, turinčios „korektūros“ veiklą, ir įtrauktos į darbo eigą.Pirmoji korektūros polimerazė Pfu buvo nustatyta 1991 m. Pyrococcus furiosus.Šis Pfu fermentas turi 3'–5' egzonukleazės aktyvumą.Kai DNR amplifikuojama, egzonukleazė pašalina nesutampančius nukleotidus 3' grandinės gale.Tada pakeičiamas tinkamas nukleotidas, o DNR sintezė tęsiasi.Neteisingų nukleotidų sekų identifikavimas pagrįstas jungimosi afinitetu prie tinkamo nukleozido trifosfato su fermentu, kai neefektyvus surišimas sulėtina sintezę ir leidžia tinkamai pakeisti.Pfu polimerazės korektūros aktyvumas lemia mažiau klaidų galutinėje sekoje, palyginti su Taq DNR polimeraze.Pastaraisiais metais buvo nustatyti kiti korektūros fermentai, o pradinio Pfu fermento modifikacijos buvo padarytos siekiant dar labiau sumažinti klaidų dažnį DNR amplifikacijos metu.

RT-PGR

Atvirkštinės transkripcijos PGR arba RT-PGR leidžia naudoti RNR kaip šabloną.Papildomas veiksmas leidžia aptikti ir amplifikuoti RNR.RNR yra atvirkštinė transkribuota į komplementarią DNR (cDNR), naudojant atvirkštinę transkriptazę.RNR šablono kokybė ir grynumas yra labai svarbūs RT-PGR sėkmei.Pirmasis RT-PGR žingsnis yra DNR/RNR hibrido sintezė.Atvirkštinė transkriptazė taip pat turi RNazės H funkciją, kuri suardo hibrido RNR dalį.Tada vienos grandinės DNR molekulę užbaigia atvirkštinės transkriptazės į cDNR nuo DNR priklausomas DNR polimerazės aktyvumas.Pirmosios grandinės reakcijos efektyvumas gali turėti įtakos amplifikacijos procesui.Nuo šiol cDNR amplifikuoti naudojama standartinė PGR procedūra.Galimybė paversti RNR į cDNR RT-PGR būdu turi daug privalumų, ir ji pirmiausia naudojama genų ekspresijos analizei.RNR yra viengrandė ir labai nestabili, todėl su ja dirbti sunku.Paprastai tai yra pirmasis qPCR žingsnis, kuris kiekybiškai įvertina RNR nuorašus biologiniame mėginyje.

qPCR ir RT-qPCR

Kiekybinis PGR (qPCR) naudojamas aptikti, apibūdinti ir kiekybiškai įvertinti nukleino rūgštis daugeliu atvejų.Atliekant RT-qPCR, RNR nuorašai dažnai kiekybiškai įvertinami, pirmiausia juos atvirkštiniu būdu transkribuojant į cDNR, kaip aprašyta aukščiau, o vėliau atliekama qPCR.Kaip ir standartiniame PGR, DNR amplifikuojama trimis pasikartojančiais etapais: denatūravimu, atkaitinimu ir pailgėjimu.Tačiau qPCR fluorescencinis žymėjimas leidžia rinkti duomenis vykstant PGR.Šis metodas turi daug privalumų dėl įvairių metodų ir cheminių medžiagų.

Naudojant dažų pagrindu pagamintą qPCR (paprastai žalią), fluorescencinis žymėjimas leidžia kiekybiškai įvertinti amplifikuotas DNR molekules, naudojant dsDNR surišančius dažus.Kiekvieno ciklo metu matuojama fluorescencija.Fluorescencinis signalas didėja proporcingai replikuotos DNR kiekiui.Vadinasi, DNR kiekybiškai įvertinama „realiu laiku“ (3 pav.).Dažais pagrįstos qPCR trūkumai yra tai, kad vienu metu galima ištirti tik vieną taikinį ir kad dažai prisijungs prie bet kurios mėginyje esančios ds-DNR.

Atliekant zondu pagrįstą qPCR, kiekviename mėginyje vienu metu galima aptikti daug taikinių, tačiau tam reikia optimizuoti ir suprojektuoti tikslinį (-ius) zondą (-us), naudojamą (-us) be pradmenų.Galimi keli zondo konstrukcijų tipai, tačiau labiausiai paplitęs tipas yra hidrolizės zondas, kuriame yra fluoroforas ir gesintuvas.Fluorescencinio rezonanso energijos perdavimas (FRET) neleidžia fluoroforui išspindėti per gesintuvą, kol zondas yra nepažeistas.Tačiau PGR reakcijos metu zondas hidrolizuojamas pradmenų pratęsimo ir specifinės sekos, su kuria jis yra prijungtas, amplifikacijos metu.Zondo skilimas atskiria fluoroforą nuo gesintuvo ir sukelia nuo amplifikacijos priklausomą fluorescencijos padidėjimą (4 pav.).Taigi, zondu pagrįstos qPCR reakcijos fluorescencinis signalas yra proporcingas mėginyje esančios zondo tikslinės sekos kiekiui.Kadangi zondu pagrįsta qPCR yra specifiškesnė nei dažų pagrindu sukurta qPCR, tai dažnai naudojama qPCR pagrįstuose diagnostiniuose tyrimuose.

Izoterminis stiprinimas

Pirmiau minėtiems PGR metodams reikalinga brangi termociklo įranga, kad būtų galima tiksliai padidinti ir sumažinti kameros temperatūrą denatūravimo, atkaitinimo ir pratęsimo etapams.Buvo sukurta daugybė metodų, kuriems nereikia tokių tikslių prietaisų ir kuriuos galima atlikti paprastoje vandens vonioje ar net dominančiose ląstelėse.Šie metodai bendrai vadinami izoterminiu stiprinimu ir veikia remiantis eksponenciniu, tiesiniu arba kaskadiniu stiprinimu.

Geriausiai žinomas izoterminio stiprinimo tipas yra kilpinis izoterminis stiprinimas arba LAMP.LAMP naudoja eksponentinį amplifikaciją esant 65 ⁰C, kad amplifikuotų šabloninę DNR arba RNR.Atliekant LAMP, naujai DNR sintetinti kartu su DNR polimeraze naudojami nuo keturių iki šešių pradmenų, papildančių tikslinės DNR sritis.Du iš šių pradmenų turi papildomas sekas, kurios atpažįsta sekas kituose pradmenyse ir jas suriša, todėl naujai susintetintoje DNR gali susidaryti „kilpos“ struktūra, kuri vėliau padeda pradmenų susijungimui kituose amplifikacijos etapuose.LAMP galima vizualizuoti keliais metodais, įskaitant fluorescenciją, agarozės gelio elektroforezę arba kolorimetriją.Lengva vizualizuoti ir aptikti produkto buvimą ar nebuvimą naudojant kolorimetriją ir dėl to, kad trūksta brangios įrangos. nebuvo įmanoma arba laboratorijose, kuriose anksčiau nebuvo PGR termociklo įrangos.