Problemų analizės vadovas

Toliau pateikiama problemų, su kuriomis galite susidurti, analizėAugalų iš visoRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Sukimo kolonėlė užsikimšusi

Užblokavus sukimosi kolonėlę, RNR išeiga sumažės arba net negalės būti išgryninta norint gauti RNR, o gautos RNR kokybė bus žema.

Įprastų priežasčių analizė:

1. Mėginys nėra visiškai sulaužytas.

Nepilnas mėginio suskaidymas gali užblokuoti DNR valymo kolonėlę, o tai taip pat gali turėti įtakos RNR išeigai ir kokybei.Atliekant mėginio suskaidymą rekomenduojame greitai susmulkinti pakankamą kiekį skysto azoto, kad kuo labiau suardytų mėginių audiniai, pvz., ląstelių sienelės ir ląstelių membranos.Polifenolinių polisacharidų augalų mėginiams rekomenduojame naudoti Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

2.Išsiurbkite DNR valymo kolonėlės išskirtą supernatantą, išsiurbkite galimas ląstelių nuolaužų nuosėdas.

Įsiurbtos ląstelių nuolaužos gali užkimšti tik RNR turinčią kolonėlę RNR adsorbcijos procedūrų metu (žr. procedūros 5 veiksmą, polisacharido polifenolio procedūros 6 veiksmą).Siurbiant šį supernatantą rekomenduojame būti atsargiems, kad būtų išvengta ląstelių nuolaužų įsiurbimo.

3. Pradinis mėginio kiekis yra per didelis.

Pernelyg didelis mėginio naudojimas sukels nepilną mėginio suskaidymą arba nepilną ląstelių lizę, naudojant buferį PRL1 arba buferį PSL1, dėl to užkimšma valymo kolonėlė, skirta valymo operacijoms.Augalų bendro RNR izoliavimo rinkinio pradinis didžiausias kiekis yra 50 mg vienam išgrynintam mėginiui.Polifenolinių polisacharidų augalų mėginiams rekomenduojame išbandyti Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

4. Centrifugos temperatūra per žema.

Visos RNR išskyrimas ir gryninimas, išskyrus mėginio audinio suardymą skystu azotu, visi etapai atliekami kambario temperatūroje (20-25 °C).Kai kurių žemos temperatūros centrifugų temperatūra yra žemesnė nei 20 °C, todėl DNR valymo kolonėlė ir (arba) tik RNR kolonėlė gali užsikimšti.Jei taip nutinka, nustatykite centrifugos temperatūrą iki 20–25 °C ir pašildykite lizės mišinį ir (arba) etanolio atskyrimo supernatantą iki 37 °C.

RNR neišskiriama arba RNR išeiga yra maža

Paprastai yra daug veiksnių, turinčių įtakos regeneravimo efektyvumui, pavyzdžiui: mėginio RNR kiekis, veikimo metodas, eliuavimo tūris ir kt.

Toliau pateikiama bendrų priežasčių analizė:

1. Operacijos metu buvo atlikta ledo vonia arba žemos temperatūros (4°C) centrifugavimas.

Patarimas: Viso proceso metu dirbkite kambario temperatūroje (15-25°C), nedarykite ledo vonios ir žemos temperatūros centrifugavimo.

       2.RNR buvo suardyta dėl netinkamo mėginio konservavimo arba ilgalaikio mėginio išsaugojimo.

Rekomendacija: Šviežiai paimtus mėginius reikia greitai užšaldyti skystame azote ir ilgai laikyti -80°C temperatūroje, vengti pakartotinio mėginių užšalimo ir atšildymo;arba iš karto pamirkykite mėginius RNR stabilizatoriaus RNAlater tirpale (gyvūnų mėginiai).

       3.Dėl nepakankamo mėginio suskaidymo ir lizės užsikemša valymo kolonėlė.

Patarimas: šlifuodami audinį įsitikinkite, kad audinys pakankamai sumaltas, ir greitai perkelkite jį į iš anksto paruoštą buferį PSL1 (patvirtinkite, kad buvo pridėta tinkama β-ME dalis, žr. 1 procedūros veiksmą).

4. Eliuentas buvo pridėtas neteisingai.

Patarimas: įsitikinkite, kad RNase-Free ddH₂O lašinamas į valymo kolonėlės membranos vidurį.

5. Į buferį PSL2 arba buferį PRW2 nebuvo pridėtas tinkamas absoliutaus etanolio tūris.

Patarimas: vadovaukitės instrukcijomis, į PSL2 ir PRW2 buferį įpilkite reikiamą absoliutaus etanolio kiekį ir gerai išmaišykite prieš naudodami rinkinį.

6. Audinių mėginio kiekis yra netinkamas.

Patarimas: naudokite 50 mg audinio 500 μl buferio PSL1.Naudojant per daug audinių sumažės išgaunamos RNR kiekis, o gautos RNR grynumas taip pat sumažės.Primygtinai rekomenduojame, kad pradinė mėginio dozė neviršytų 50 mg vienai RNR ekstrahavimo operacijai.

7. Netinkamas eliuavimo tūris arba nepilnas eliuavimas.

Siūlymas: gryninimo kolonėlės eliuento tūris yra 50-200 μl;jei eliuavimo efektas nepatenkinamas, rekomenduojama pratęsti laiką kambario temperatūroje po pašildyto RNase-Free ddH₂O, pavyzdžiui, 5-10 min.

8. Išplovus buferiu PRW2, valymo kolonėlėje yra etanolio likučių.

   Patarimas: jei tuščias mėgintuvėlis centrifuguojamas 1 min., o po plovimo buferyje PRW2 vis dar liko etanolio, galite padidinti tuščio mėgintuvėlio centrifugavimo laiką iki 2 min. arba padėkite valymo kolonėlę kambario temperatūroje 5 min., kad visiškai pašalintumėte likutinį etanolį.

9. Rinkinys buvo naudojamas netinkamai.

   Patarimas: polifenolinių polisacharidų augalų mėginiams, naudojant įprastus rinkinius, tokius kaip Plant Total RNA Isolation Kit, gali nepavykti gauti idealių RNR mėginių.Rekomenduojame naudoti Plant Total RNA IsolationKit Plus, kuris yra specialiai sukurtas polifenolinių polisacharidų augalų mėginiams.Rinkinys, specialiai sukurtas RNR ekstrahavimui iš polifenolių ir polisacharidų augalų mėginių.

OD260/OD280 vertė yra maža

RNR eliuavimas su ddH₂O ir naudojamas spektrofotometro rodmenims nulemti mažas OD260/OD280 vertes.Rekomenduojame naudoti 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (o ne RNazės neturintį ddH₂O eliuuoti RNR), kad gautumėte santykinai teisingas OD260/OD280 vertes, žr. „RNR koncentracijos ir gryninimo tyrimai“ 19 puslapyje.

Išgryninta RNR suskaidoma

Išgrynintos RNR kokybė yra susijusi su tokiais veiksniais kaip mėginio išsaugojimas, užteršimas Rnaze ir manipuliavimas.

Įprastų priežasčių analizė:

1. Audinių mėginiai nebuvo laiku laikomi po paėmimo.

    Rekomendacija: Jei po paėmimo audinių mėginiai nepanaudojami laiku, nedelsdami laikykite juos skystame azote žemoje temperatūroje arba perkelkite į -80°C ilgalaikiam saugojimui po greito užšaldymo skystame azote arba nedelsdami panardinkite mėginius į RNR stabilizatoriaus RNAlater tirpalą (gyvūnų mėginiai).RNR ekstrahavimui pabandykite naudoti ką tik paimtus audinių mėginius.

2.Pakartotinis audinių mėginių užšaldymas ir atšildymas.

   Patarimas: Laikant audinių mėginius, geriausia juos supjaustyti į mažus gabalėlius konservavimui, o naudojant dalį išimti, kad būtų išvengta RNR skilimo, kurį sukelia pakartotinis mėginių užšaldymas ir atšildymas.

3.RNase įvedama į operacijų kambarį arba nedėvimos vienkartinės pirštinės, kaukės ir pan.

   Patarimas: RNR ekstrahavimo eksperimentus geriausia atlikti atliekant atskiras RNR operacijas, o prieš eksperimentą nuvalyti laboratorijos stalą, o eksperimento metu mūvėti vienkartines pirštines ir kaukes, kad būtų išvengta RNR degradacijos, kurią sukelia RNazės įvedimas.

4. Naudojimo metu reagentas yra užterštas RNaze.

   Patarimas: susijusiems eksperimentams pakeiskite nauja augalų bendros RNR ekstrahavimo rinkinių serija.

5. RNR manipuliavimui naudojami centrifugos mėgintuvėliai ir pipetės antgaliai yra užteršti RNaze.

Patarimas: Įsitikinkite, kad centrifugos mėgintuvėliai, pipetės antgaliai, pipetės ir kt., naudojami RNR ekstrahavimui, yra be RNazės.

Instrukcijų vadovai:

Plant Total RNA izoliacijos rinkinio naudojimo vadovas