Ankstyvoje protrūkio stadijoje dėl spartaus vystymosi greita įtariamų pacientų diagnostika yra raktas į COVID-19 prevenciją.Kai kurių patvirtintų nukleino rūgščių aptikimo reagentų kūrimo laikas yra trumpas, be to, kyla problemų, tokių kaip skubotas veikimo patvirtinimas, nepakankamas reagento optimizavimas ir dideli partijų skirtumai;Įvairių klinikinių laboratorijų problemos įvairiuose nukleorūgščių aptikimo proceso aspektuose taip pat gali turėti įtakos nukleorūgščių aptikimo rezultatų tikslumui.Šiame straipsnyje daugiausia dėmesio bus skiriama pagrindinėms dabartinės SARS-CoV-2 nukleorūgščių aptikimo sąsajoms ir taškams bei analizuojamos klaidingai neigiamo ir teigiamo laboratorinio nukleorūgščių aptikimo pakartotinio tyrimo ir klinikinio nenuoseklumo problemos.

SARS-CoV-2 nukleorūgščių aptikimo principai

SARS-CoV-2 yra RNR virusas, kurio genomo seka yra apie 29 kb, su 10 genų, kurie gali veiksmingai koduoti 10 baltymų.Virusai susideda iš RNR ir baltymų, o atokiausias sluoksnis yra išorinė danga, sudaryta iš lipidų ir glikoproteinų.Viduje baltymo kapsidas apgaubia joje RNR, taip apsaugodamas lengvai skaidomą RNR (P1).

P1 SARS-COV-2 struktūra

Virusai įsiveržia į ląsteles per specifinius ląstelės paviršiaus receptorius, kad sukeltų infekciją, o dauginimuisi naudoja ląsteles-šeimininkes.

Viruso nukleino rūgščių aptikimo principas yra atskleisti viruso RNR per ląstelių lizatą, o tada aptikimui naudoti realaus laiko fluorescencinę atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininę reakciją (RT-PCR).

Aptikimo principo raktas yra naudoti pradmenis ir zondus, kad būtų pasiektas „tikslinis nukleino rūgščių sekų atitikimas“, ty rasti SARS-CoV-2 nukleino rūgščių seką, kuri skiriasi nuo kitų virusų maždaug 30 000 bazių (nukleorūgščių panašumas į kitus virusus), „žemas“ plotas), projektuoti pradmenis ir zondus.

Pradmenys ir zondai yra labai suderinti su specifiniu SARS-CoV-2 nukleorūgšties regionu, tai yra, specifiškumas yra labai stiprus.Kai tiriamo mėginio realiuoju laiku fluorescencinės RT-PGR amplifikacijos rezultatas yra teigiamas, tai įrodo, kad mėginyje yra SARS-CoV-2.Žiūrėkite P2.

P2 SARS-CoV-2 nukleorūgščių nustatymo etapai (realaus laiko fluorescencinė RT-PGR)

SARS-CoV-2 nukleorūgščių aptikimo laboratorijos sąlygos ir reikalavimai

Nukleino rūgščių tyrimo laboratorijos yra idealiausios neigiamo slėgio aplinkai, jos turėtų atkreipti dėmesį į slėgio stebėjimą, palaikyti oro srautą ir pašalinti aerozolius.Nukleino rūgščių testavimo personalas turi turėti atitinkamą kvalifikaciją, gauti atitinkamą polimerazės grandininės reakcijos mokymą ir išlaikyti įvertinimą.Laboratorija turi būti griežtai tvarkoma, suskirstyta į zonas, o nesusijusiam personalui griežtai draudžiama įeiti.Švari vieta turi būti vėdinama ir dezinfekuojama vietoje.Atitinkami daiktai dedami į zonas, švarūs ir nešvarūs atskiriami, laiku pakeičiami ir nukenksminami vietoje.Įprasta dezinfekcija: chloro turintis dezinfekantas yra pagrindinis sprendimas didesniems plotams, o 75% alkoholio galima naudoti mažiems plotams.Geras būdas kovoti su aerozoliais yra atidaryti langus vėdinimui, oro dezinfekcija taip pat gali būti atliekama ultravioletiniais spinduliais, filtravimu ir oro dezinfekcija.

Pagrindinės SARS-CoV-2 nukleorūgščių nustatymo sąsajos ir parametrai (realaus laiko fluorescencinė RT-PGR)

Nors laboratorijos paprastai daug dėmesio skiria nukleino rūgščių „aptikimui“, iš tikrųjų nukleorūgščių „išskyrimas“ taip pat yra vienas iš pagrindinių sėkmingo aptikimo žingsnių, glaudžiai susijusių su virusų mėginių surinkimu ir saugojimu.

Šiuo metu plačiausiai naudojami kvėpavimo mėginiai, tokie kaip nosiaryklės tamponai, naudoja antrąjį metodą, tai yra inaktyvavimo (konservavimo) tirpalas, paruoštas remiantis nukleino rūgščių ekstrahavimu ir lizės tirpalu.Viena vertus, šis viruso konservavimo tirpalas gali denatūruoti viruso baltymą, prarasti savo aktyvumą ir nebebūti užkrečiamas, taip pat pagerinti transportavimo ir aptikimo etapo saugumą;kita vertus, jis gali tiesiogiai nulaužti virusą, kad išleistų nukleino rūgštį, pašalintų nukleino rūgštis skaidantį fermentą ir užkirstų kelią virusui.RNR suskaidoma.

Viruso mėginių ėmimo tirpalas, paruoštas remiantis nukleorūgščių ekstrahavimo lizės tirpalu.Pagrindiniai komponentai yra subalansuotos druskos, etilendiamintetraacto rūgšties kompleksonas, guanidino druska (guanidino izotiocianatas, guanidino hidrochloridas ir kt.), anijoninė aktyvioji paviršiaus medžiaga (dodekanas) natrio sulfatas), katijoninė aktyvioji paviršiaus medžiaga (tetradeciltrimetilamonio Kvinolatas, dihidrohenoloksioksalinas, dihidrohenoloksioksalinas8), kiti keli ar daugiau komponentų.Šiuo metu yra daug rūšių nukleorūgščių ekstrahavimo rinkinių, naudojami įvairūs nukleorūgščių ekstrahavimo ir gryninimo reagentai.Net jei naudojamas tas pats nukleorūgščių ekstrahavimo ir gryninimo reagentas, kiekvieno rinkinio ekstrahavimo procedūros skiriasi.

Šiuo metu Nacionalinės medicinos produktų administracijos patvirtinti nukleorūgščių aptikimo rinkinio produktai yra atrenkami pagal SARS-CoV-2 genome esančius ORF1ab, E ir N genus.Įvairių gaminių aptikimo principai iš esmės yra vienodi, tačiau jų pradmenys ir zondų konstrukcija skiriasi.Yra vieno taikinio segmentai (ORF1ab), dviejų tikslinių segmentų (ORF1ab, N arba E) ir trijų tikslinių segmentų (ORF1ab, N ir E).Skirtumas tarp aptikimo ir interpretavimo, nukleorūgščių ekstrahavimo ir realaus laiko fluorescencinės RT-PGR reakcijos sistemos turėtų būti nurodytas atitinkamose rinkinio instrukcijose, todėl naudotojams rekomenduojama griežtai laikytis rinkinio aiškinimo instrukcijose nurodyto aiškinimo metodo.Bendros sritys, pradmenys ir zondo sekos, sustiprintos realiuoju laiku fluorescencine RT-PCR, parodytos P3.

P3 SARS-CoV-2 amplikono taikinio vieta genome ir pradmenų bei zondų seka

SARS-CoV-2 nukleorūgščių nustatymo rezultatų aiškinimas (REal-Time fluorescencinis RT-PCR)

„SARS-CoV-2 infekcijos pneumonijos prevencijos ir kontrolės planas (antrasis leidimas)“ pirmą kartą išaiškino vieno geno amplifikacijos rezultatų vertinimo kriterijus:

1. Nėra Ct arba Ct≥40 yra neigiamas;

2. Ct<37 yra teigiamas;

3. Ct reikšmė 37–40 yra pilkos spalvos sritis.Rekomenduojama eksperimentą pakartoti.Jei pakartotinio Ct <40 rezultatas ir amplifikacijos kreivė turi akivaizdžių smailių, mėginys vertinamas kaip teigiamas, kitu atveju jis yra neigiamas.

Trečiasis vadovo leidimas ir ketvirtasis vadovo leidimas tęsė aukščiau nurodytus kriterijus.Tačiau dėl skirtingų komerciniuose rinkiniuose naudojamų taikinių, minėtame 3-iajame vadovo leidime nebuvo pateikti taikinių derinio nustatymo kriterijai, pabrėžiant, kad pirmenybė teikiama gamintojo pateiktoms instrukcijoms.Nuo penktojo gairių leidimo buvo patikslinti du tikslai, ypač vieno tikslo, kurį sunku įvertinti, vertinimo kriterijai.Tai yra, jei laboratorija nori patvirtinti, kad SARS-CoV-2 nukleorūgščių aptikimo atvejis yra teigiamas, turi būti įvykdyta viena iš 2 sąlygų:

(1) Dviejų SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) taikinių, esančių tame pačiame mėginyje, rezultatai buvo teigiami naudojant fluorescencinę RT-PGR realiuoju laiku.Jei vienas tikslas yra teigiamas, reikia pakartotinai paimti mėginius ir atlikti pakartotinį tyrimą.Jei bandymo rezultatai yra Jei vienas tikslas vis dar teigiamas, jis vertinamas kaip teigiamas.

(2) Dviejų realaus laiko fluorescencinės RT-PGR pavyzdžiai parodė vieną teigiamą taikinį tuo pačiu metu arba du to paties tipo mėginiai parodė vieną teigiamą taikinio tyrimo rezultatą, kuris gali būti vertinamas kaip teigiamas.Tačiau gairėse taip pat pabrėžiama, kad neigiami nukleorūgščių tyrimo rezultatai negali atmesti SARS-CoV-2 infekcijos.Reikia atmesti veiksnius, galinčius sukelti klaidingus neigiamus rezultatus, įskaitant prastą mėginių kokybę (kvėpavimo takų mėginiai iš burnos ir ryklės ir kitų dalių), mėginių paėmimą per anksti arba per vėlai, mėginiai nebuvo tinkamai saugomi, transportuojami ir apdoroti, o pati technologija turėjo problemų (viruso kitimas, PGR slopinimas) ir kt.

Aptikimo SARS-CoV-2 klaidingų neigiamų rezultatų priežastys

Šiuo metu nagrinėjama sąvoka „klaidingai neigiamas“ nukleino rūgščių tyrimuose dažnai reiškia „klaidingus neigiamus“, kai nukleorūgščių tyrimo rezultatai nesutampa su klinikinėmis apraiškomis, ty klinikiniai simptomai ir vaizdo gavimo rezultatai yra labai įtariami COVID-19, tačiau nukleorūgščių testai visada yra „neigiami“ daug kartų.Nacionalinės sveikatos komisijos Klinikinės laboratorijos centras paaiškino „klaidingai neigiamą“ SARS-CoV-2 testą.

(1) Užkrėsto žmogaus ląstelėse yra tam tikras viruso kiekis.Turimi duomenys rodo, kad virusu užsikrėtus organizmui, virusas per nosį ir burną patenka į gerklę, vėliau į trachėją ir bronchus, o vėliau pasiekia alveoles.Užsikrėtęs asmuo patirs inkubacinį periodą, nežymius simptomus, o vėliau – sunkių simptomų procesą ir skirtingas ligos stadijas.Ir viruso kiekis įvairiose kūno vietose yra skirtingas.

Kalbant apie ląstelių tipų virusinį krūvį, alveolių epitelio ląstelės (apatiniai kvėpavimo takai)> kvėpavimo takų epitelio ląstelės (viršutiniai kvėpavimo takai)> fibroblastai, endotelio ląstelės ir makrofagai ir kt.;iš mėginio tipo, alveolių plovimo skystis (puikiausias)>giliai kosint skrepliai>nosiaryklės tamponas>burnos ir ryklės tepinėlis>kraujas.Be to, virusą galima aptikti ir išmatose.Tačiau, atsižvelgiant į operacijos patogumą ir pacientų priėmimą, dažniausiai naudojamas klinikinių mėginių užsakymas yra burnos ir ryklės tepinėlis> nosiaryklės tepinėlis> bronchų plovimo skystis (sudėtinga operacija) ir gilūs skrepliai (dažniausiai sausas kosulys, sunkiai gaunamas).

Todėl kai kurių pacientų burnos ir ryklės ar nosiaryklės ląstelėse viruso kiekis yra mažas arba itin mažas.Jei tyrimui imami tik burnos ir nosiaryklės mėginiai, viruso nukleorūgštis nebus aptikta.

(2) Imant mėginius nebuvo surinkta virusų turinčių ląstelių arba viruso nukleorūgštis nebuvo veiksmingai išsaugota.

[① Netinkama paėmimo vieta, pvz., renkant burnos ir ryklės tepinėlius, nepakanka surinkimo gylio, paimti nosiaryklės tepinėliai nėra surenkami giliai į nosies ertmę ir pan. Dauguma surinktų ląstelių gali būti ląstelės be virusų;

② Mėginių ėmimo tamponai naudojami netinkamai.Pavyzdžiui, tampono galvutės medžiagai rekomenduojama naudoti sintetinius pluoštus, tokius kaip PE pluoštas, poliesterio pluoštas ir polipropileno pluoštas.Faktiškai naudojami natūralūs pluoštai, tokie kaip medvilnė (stipri baltymų adsorbcija ir nelengva išplauti) ir nailono pluoštai (prastas vandens sugėrimas, dėl to nepakanka mėginių ėmimo);

③Neteisingas virusų laikymo mėgintuvėlių naudojimas, pvz., netinkamai naudojami polipropileniniai arba polietileniniai plastikiniai laikymo vamzdeliai, kurie lengvai sugeria nukleino rūgštis (DNR/RNR), dėl to sumažėja nukleino rūgšties koncentracija laikymo tirpale.Praktikoje virusinėms nukleino rūgštims laikyti rekomenduojama naudoti polietileno-propileno polimerinį plastiką ir kai kuriuos specialiai apdorotus polipropileno plastikinius indus.]

[① Netinkama paėmimo vieta, pvz., renkant burnos ir ryklės tepinėlius, nepakanka surinkimo gylio, paimti nosiaryklės tepinėliai nėra surenkami giliai į nosies ertmę ir pan. Dauguma surinktų ląstelių gali būti ląstelės be virusų;

② Mėginių ėmimo tamponai naudojami netinkamai.Pavyzdžiui, tampono galvutės medžiagai rekomenduojama naudoti sintetinius pluoštus, tokius kaip PE pluoštas, poliesterio pluoštas ir polipropileno pluoštas.Faktiškai naudojami natūralūs pluoštai, tokie kaip medvilnė (stipri baltymų adsorbcija ir nelengva išplauti) ir nailono pluoštai (prastas vandens sugėrimas, dėl to nepakanka mėginių ėmimo);

③Neteisingas virusų laikymo mėgintuvėlių naudojimas, pvz., netinkamai naudojami polipropileniniai arba polietileniniai plastikiniai laikymo vamzdeliai, kurie lengvai sugeria nukleino rūgštis (DNR/RNR), dėl to sumažėja nukleino rūgšties koncentracija laikymo tirpale.Praktikoje virusinėms nukleino rūgštims laikyti rekomenduojama naudoti polietileno-propileno polimerinį plastiką ir kai kuriuos specialiai apdorotus polipropileno plastikinius indus.]

(4) Klinikinės laboratorinės operacijos nėra standartizuotos.Mėginių transportavimo ir laikymo sąlygos, standartizuotas klinikinių laboratorijų darbas, rezultatų interpretavimas ir kokybės kontrolė yra pagrindiniai veiksniai, užtikrinantys tyrimų rezultatų tikslumą ir patikimumą.Nacionalinės sveikatos komisijos Klinikinių laboratorijų centro 2020 m. kovo 16-24 dienomis atlikto išorinio kokybės vertinimo duomenimis, iš 844 galiojančius rezultatus gavusių laboratorijų 701 (83,1 proc.) buvo kvalifikuotos, o 143 (16,9 proc.) – ne.Kvalifikuota, bendros laboratorinių tyrimų sąlygos yra geros, tačiau skirtingose ​​laboratorijose vis dar skiriasi personalo gebėjimas dirbti, vieno tikslo teigiamo mėginio interpretavimo galimybės ir kokybės kontrolė.

Kaip sumažinti klaidingai neigiamą SARS-CoV-2 nukleorūgščių aptikimo skaičių?

Klaidingų neigiamų rezultatų mažinimas nustatant nukleino rūgštis turėtų būti optimizuotas atsižvelgiant į keturis klaidingų neigiamų rezultatų gavimo aspektus.

(1) Užkrėsto asmens ląstelėse yra tam tikras viruso kiekis.Viruso koncentracija įvairiose įtariamų užsikrėtusių asmenų kūno vietose skirtingu metu skirsis.Jei ryklės nėra, tai gali būti bronchų plovimo skystyje arba išmatose.Jei tyrimui vienu metu arba skirtinguose ligos progresavimo etapuose galima paimti kelių tipų mėginius, padės išvengti klaidingų neigiamų rezultatų.

(2) Ląstelės, kuriose yra viruso, turėtų būti renkamos imant mėginius.Šią problemą didele dalimi galima išspręsti sustiprinus mėginių rinkėjų mokymą.

(3) Patikimi IVD reagentai.Atliekant reagentų aptikimo efektyvumo vertinimo tyrimus nacionaliniu lygmeniu, aptariant esamas problemas, galima dar labiau pagerinti reagentų aptikimo efektyvumą ir analizės jautrumą.

(4) Standartizuotas klinikinių laboratorijų darbas.Stiprinant laboratorijos personalo mokymą, nuolat tobulinant laboratorijos kokybės valdymo sistemą, užtikrinant pagrįstus padalijimus, gerinant personalo gebėjimą aptikti, galima sumažinti klaidingus neigiamus rezultatus dėl netinkamos laboratorinės veiklos.

Priežastys, dėl kurių pakartotinis SARS-CoV-2 nukleorūgščių testas buvo teigiamas pasveikusiems ir išrašytiems pacientams

„COVID-19 diagnostikos ir gydymo plane (septintoji bandomoji versija)“ aiškiai nustatyta, kad vienas iš COVID-19 pacientų išgydymo ir išrašymo iš ligoninės kriterijų yra tai, kad dviejų iš eilės kvėpavimo takų mėginių nukleorūgščių testas yra neigiamas (mažiausiai 24 valandų intervalas), tačiau yra labai nedaug priežasčių, dėl kurių SARS-CoV-2 nukleino rūgšties testas vėl buvo teigiamas.

(1) SARS-CoV-2 yra naujas virusas.Būtina toliau suprasti jo patogeninį mechanizmą, visą sukeltos ligos vaizdą ir ligos eigos ypatybes.Todėl, viena vertus, būtina stiprinti išrašytų pacientų valdymą ir atlikti 14 dienų medicininį stebėjimą.Atlikite tolesnius veiksmus, sveikatos stebėjimą ir rekomendacijas dėl sveikatos, kad suprastumėte visą ligos atsiradimo, vystymosi ir baigties procesą.

(2) Pacientas gali vėl užsikrėsti virusu.Akademikas Zhong Nanshan sakė: Kadangi išgydyti pacientai turi antikūnų, SARS-CoV-2 gali būti pašalintas antikūnais, kai jie vėl įsiveržia.Priežasčių yra daug, kurios gali būti ir pasveikusio paciento priežastimi, ir su viruso mutacija, ar net laboratorinių tyrimų priežastimi.Jei tai yra pats virusas, dėl SARS-CoV-2 mutacijos pasveikusio paciento gaminami antikūnai gali būti neveiksmingi prieš mutavusį virusą.Jei pacientas vėl užsikrečia mutavusiu virusu, nukleorūgščių testas vėl gali būti teigiamas.

(3) Kalbant apie laboratorinių tyrimų metodus, kiekvienas tyrimo metodas turi savo apribojimų.SARS-CoV-2 nukleorūgščių aptikimas vyksta dėl genų sekos pasirinkimo, reagentų sudėties, metodo jautrumo ir kitų priežasčių, todėl esami rinkiniai turi savo žemesnes aptikimo ribas.Po paciento gydymo viruso organizme mažėja.Kai viruso kiekis tiriamame mėginyje yra mažesnis už apatinę aptikimo ribą, pasirodys „neigiamas“ rezultatas.Tačiau šis rezultatas nereiškia, kad virusas organizme visiškai išnyko.Virusas gali būti po gydymo nutraukimo.Atgimimas“, toliau kopijuokite.Todėl rekomenduojama peržiūrėti kartą per savaitę per 2–4 savaites po išrašymo.

(4) Nukleino rūgštis yra viruso genetinė medžiaga.Virusas žūva po to, kai pacientui buvo atliktas antivirusinis gydymas, tačiau likę viruso RNR fragmentai vis dar išlieka žmogaus organizme ir nėra visiškai pašalinami iš organizmo.Kartais tam tikromis aplinkybėmis jis gali būti labiau išlaikytas.Ilgą laiką ir šiuo metu nukleorūgščių testas bus „laikinas“ teigiamas.Ilgėjant paciento atsigavimo laikui, po to, kai organizme liekamieji RNR fragmentai palaipsniui išsenka, nukleorūgščių tyrimo rezultatas gali būti neigiamas.

(5) SARS-CoV-2 nukleino rūgščių tyrimo rezultatai įrodo tik viruso RNR buvimą arba nebuvimą ir negali įrodyti viruso aktyvumo ir viruso perdavimo.Reikia įrodyti, ar pacientas, kurio nukleorūgščių testas vėl teigiamas, vėl taps infekcijos šaltiniu.Norint įrodyti, kad jis yra užkrečiamas, būtina atlikti viruso kultūrą iš klinikinių mėginių ir kultivuoti „gyvą“ virusą.

Santrauka

Apibendrinant galima pasakyti, kad SARS-CoV-2 nukleorūgščių testas klaidingai neigiamas, pakartotinis testas yra teigiamas ir negali būti visiškai išvengta kitų sąlygų, kurios neatitinka klinikinių apraiškų.Atliekant tikrąją atranką ir testavimą, rekomenduojama derinti klinikinius simptomus, vaizdinius tyrimus (KT) ir eksperimentus Laboratorinio tyrimo (nukleorūgščių tyrimas + viruso specifinių antikūnų tyrimas) rezultatus, kad būtų galima visapusiškai diagnozuoti, kad būtų išvengta praleistos diagnozės ir klaidingos diagnozės.Nustačius, kad tyrimo rezultatai akivaizdžiai neatitinka klinikinių apraiškų, rekomenduojama atlikti išsamią visos tyrimo grandies (mėginių paėmimo, cirkuliacijos ir apdorojimo sąsajų) analizę, kad būtų išvengta ankstyvos SARS-CoV-2 viruso infekcijos, pasikartojančios infekcijos arba kartu su kitomis kvėpavimo takų virusinėmis infekcijomis ir pan.Jei sąlygos leidžia, pakartotiniam tyrimui rekomenduojama paimti jautresnius mėginius, tokius kaip skreplių ar alveolių plovimo skysčio.

Susiję produktai:

SARS-CoV-2 nukleorūgščių aptikimo rinkinys (daugiasluoksnis PGR fluorescencinio zondo metodas)