Pradmenų ir zondų veikimo patikrinimas ankstyvoje PGR reagentų stadijoje ir tinkamiausių reakcijos sąlygų nustatymas yra būtinos sąlygos, kad būtų užtikrinta sklandi formalių eksperimentų eiga.
Taigi, kaip mums reikia patvirtinti pradmenų zondą ankstyvoje stadijoje?
Pagrindiniai rodikliai yra bazinė linija, amplifikacijos kreivė, ct reikšmė, stiprinimo efektyvumas, mažos koncentracijos mėginio aptikimas, CV ir kt.
Bazinė linija
Bazinė linija yra horizontali linija PGR amplifikacijos kreivėje.Per pirmuosius kelis PGR amplifikacijos reakcijos ciklus fluorescencinis signalas beveik nesikeičia ir sudaro tiesią liniją.Ši tiesi linija yra pagrindinė linija.
Tikrindami PGR pradmenų zondus, atkreipkite dėmesį, ar bazinė linija yra lygi.Pradmenų zondo koncentracijos grynumas turės įtakos bazinei linijai, pvz., pradinės linijos pakilimas arba kritimas.Bazinė linija taip pat yra labai intuityvus rodiklis.
Amplifikacijos kreivė
Kitas intuityvus indikatorius yra stiprinimo kreivės forma.Geriausia turėti S formos kreivę, kad būtų išvengta antrinio stiprinimo ar kitų nenormalių stiprinimo kreivių.
Ct vertė
Ciklų skaičius, atitinkantis vingio tašką nuo bazinės linijos iki eksponentinės augimo, yra Ct reikšmė.
Tam pačiam mėginiui skirtingi pradmenų zondai sukuria skirtingas amplifikacijos kreives, o atitinkamą Ct vertę paveiks stiprinimo efektyvumas ir trukdžių laipsnis.Teoriškai, kuo mažesnė pasirinkto pradmenų zondo Ct reikšmė, tuo geriau.
Stiprinimo efektyvumas
Vienas iš patikimiausių ir stabiliausių PGR amplifikacijos efektyvumo vertinimo metodų yra standartinė kreivė, kurią taip pat plačiai pripažįsta mokslininkai.Šis metodas apima mėginių serijos sudarymą, kad būtų galima kontroliuoti santykinį tikslinių šablonų skaičių.Šie mėginiai paprastai gaminami nuosekliai skiedžiant koncentruotus pradinius tirpalus, dažniausiai naudojamas 10 kartų praskiedimas.Naudojant atskiestų mėginių seriją, naudojant standartinę qPCR programą amplifikuoti, kad gautume Cq reikšmę, ir galiausiai nubrėžti standartinę kreivę pagal kiekvieno mėginio koncentraciją ir atitinkamą Cq reikšmę, kad gautume tiesinę lygtį Cq= -klgX0+b, o stiprinimo efektyvumą E=10(-1 /k)-1.Naudojant qPCR kiekybinei analizei, amplifikacijos efektyvumas turi būti 90–110 % (3,6>k>3,1).
Mažos koncentracijos mėginių aptikimas
Kai mėginio koncentracija yra maža, skirtingų pradmenų zondų aptikimo greitis yra skirtingas.Atrenkame 20 mažos koncentracijos mėginių, kuriuos norite pakartoti, o pradmenų-zondo sistema, turinti didžiausią aptikimo greitį, yra geriausia.
Variacijos koeficientas (CV)
Su skirtingais pradmenų zondais galima aptikti 10 pasikartojančių mėginių pagal nukleorūgščių amplifikacijos aptikimo reagento linijos standartą.
Kiekybiniai reagentai:
Tikslumas
Vienos partijos tikslumas turi atitikti: tiriamosios koncentracijos logaritminės vertės variacijos koeficientas (CV,%) yra ≤5%.Kai mėginio koncentracija maža, aptikimo koncentracijos logaritmo variacijos koeficientas (CV,%) yra ≤10%.
Kokybiški reagentai:
Tikslumas
Vienos partijos tikslumas turi atitikti:
(1) Ct vertės variacijos koeficientas (CV, %) ≤5 %
Tas pats mėginys lygiagrečiai tiriamas 10 kartų, o tyrimo rezultatai turi būti nuoseklūs
Paskelbimo laikas: 2021-09-18
