Tikiu, kad kiekvienas, atlikdamas PGR reakcijas, visada susidurs su tokiomis ar tokiomis problemomis, tačiau daugumą jų galima suskirstyti į dvi pagrindines problemas:

Per mažas geno šablono amplifikavimas (amplifikacija);
Per daug netikslinio geno amplifikacijos.
Priedų naudojimas yra viena iš įprastų šių problemų sprendimo strategijų.Paprastai priedų vaidmuo turi du aspektus:
antrinė struktūragenų (antrinės struktūros);
Sumažinkite nespecifinį gruntavimą.
Šiandien redaktorius trumpai supažindins su įprastais priedais PGR reakcijose ir jų funkcijomis.
Priedai, mažinantys antrinę struktūrą
sulfoksidas(DMSO)
genų mėginiaisu dideliu GC kiekiu.Tačiau DMSO taip pat labai sumažina Taq polimerazės aktyvumą.Todėl kiekvienas turi subalansuoti šablono prieinamumą ir polimerazės aktyvumą.Redaktorius siūlo išbandyti skirtingas DSMO koncentracijas, pvz., nuo 2% iki 10%, kad rastumėte koncentraciją, kuri tinka jūsų eksperimentui.
Nejoniniai plovikliai
Nejoniniai plovikliai, tokie kaip 0,1–1 % Triton X-100, Tween 20 arba NP-40, paprastai mažina DNR antrinę struktūrą.Nors tai gali padidinti šablono geno amplifikaciją, tai taip pat sukels nespecifinio amplifikacijos problemų.Taigi, šie priedai gerai tinka mažo našumo PGR reakcijoms be šiukšlių, bet ne taip gerai santykinai nešvarioms KLR reakcijoms.Kitas nejoninių ploviklių pranašumas yra SDS taršos mažinimas.Paprastai DNR ekstrahavimo proceso metu SDS patenka į PGR etapą, o tai labai slopina polimerazės aktyvumą.Todėl į reakciją pridėjus 0,5% Tween-20 arba Tween-40, galima neutralizuoti neigiamą SDS poveikį.
Betainas_
Betainas gali pagerinti DNR amplifikaciją sumažindamas antrinės struktūros formavimąsi ir paprastai yra „paslaptingas“ komercinių PGR rinkinių papildymas.Jei norite naudoti betainą, turėtumėte dėti betainą arba betaino monohidratą (betainą arba betaino monohidratą), bet ne betaino hidrochloridą (Betain HCl), sureguliuokite galutinę koncentraciją 1–1,7 M.Betainas taip pat gali padėti pagerinti specifiškumą, nes pašalina DNR lydymosi / DNR denatūravimo priklausomybę nuo bazinių porų sudėties.
Nespecifinio gruntavimo mažinimo priedai
Foramidas
Foramidas yra dažniausiai naudojamas organinis PGR priedas.Jis gali būti sujungtas su pagrindiniu ir nedideliu DNR grioveliu, taip sumažinant pagrindinės DNR dvigubos spiralės stabilumą ir sumažinant DNR lydymosi temperatūrą.PGR eksperimentuose naudojama formamido koncentracija paprastai yra 1–5%.
Tetrametilasamonio chloridas( TMAC)
Tetrametilamonio chloridas gali padidinti hibridizacijos specifiškumą (hibridizacijos specifiškumą) ir padidinti DNR lydymosi temperatūrą.Taigi, TMAC gali pašalinti nespecifinį pradėjimą ir sumažinti netinkamą DNR ir RNR surišimą.Jei naudojateišsigimę pradmenysPGR reakcijoje nepamirškite pridėti TMAC, kuris paprastai naudojamas esant 15–100 mM koncentracijai.
Kiti įprasti priedai
Be dviejų aukščiau paminėtų priedų kategorijų, PGR reakcijose yra daug įprastų priedų, nors jie atlieka skirtingas funkcijas, jie taip pat yra labai svarbūs.
Magnio jonas
Magnio jonas yra nepakeičiamas polimerazės kofaktorius (kofaktorius), ty be magnio jonų polimerazė yra neaktyvi.Tačiau per daug magnio jonų taip pat gali turėti įtakos polimerazės efektyvumui.Magnio jonų koncentracija kiekvienoje PGR reakcijoje skirsis.Chelatiniai agentai (pvz., EDTA arba citratas), dNTP ir baltymų koncentracija turi įtakos magnio jonų koncentracijai.Taigi, jei turite problemų su PGR eksperimentu, galite pabandyti pakeisti skirtingas magnio jonų koncentracijas, pavyzdžiui, nuo 1,0 iki 4,0 mM, su 0,5–1 mM intervalu.
Verta paminėti, kad keli užšaldymo ir atšildymo ciklai gali sukelti magnio chlorido tirpalo koncentracijos stratifikaciją.Todėl prieš kiekvieną naudojimą turite jį visiškai ištirpinti ir prieš naudodami gerai išmaišyti.
Galvijų serumo albuminas(galvijų albuminas, BSA)
Molekulinės chemijos eksperimentuose galvijų serumo albuminas yra labai dažnas priedas, ypač restrikcijos fermentų virškinimo ir PGR eksperimentuose.PGR reakcijose BSA padeda sumažinti teršalus, tokius kaip fenolio junginiai.Taip pat teigiama, kad jis gali sumažinti reagentų sukibimą su mėgintuvėlio sienele.PGR reakcijos metu paprastai pridedamo BSA koncentracija gali siekti 0,8 mg/ml.
 
Susiję produktai:
PGR herojus(su dažais)
PGR herojus