Tiesioginė PGR yra reakcija, kurios metu amplifikacijai tiesiogiai naudojami gyvūnų arba augalų audiniai be nukleino rūgšties ekstrahavimo.Daugeliu atžvilgių tiesioginis PGR veikia kaip įprastas PGR

Pagrindinis skirtumas yra pasirinktinis buferis, naudojamas tiesioginėje PGR, mėginys gali būti tiesiogiai veikiamas PGR reakcija be nukleino rūgšties ekstrahavimo, tačiau yra atitinkami fermentų tolerancijos ir tiesioginėje PGR reakcijoje dalyvaujančio buferio suderinamumo reikalavimai.

Nors įprastuose mėginiuose yra daugiau ar mažiau PGR inhibitorių, tiesioginis PGR vis tiek gali pasiekti patikimą amplifikaciją veikiant fermentams ir buferiams.Tradicinei PGR reakcijai reikalinga aukštos kokybės nukleino rūgštis kaip šablonas, kuris gali slopinti sklandų PGR reakcijos eigą, jei šablone yra baltymų ir kitų priemaišų.Tiesioginis PGR šiuo metu yra viena iš populiariausių technologijų molekulinės diagnostikos srityje.

01 Tiesioginis PGR iš pradžių buvo naudojamas gyvūnams ir augalams

Anksčiausias tiesioginis PGR taikomas gyvūnų ir augalų srityse, pvz., žiurkių, kačių, vištų, triušių, avių, galvijų kraujas, audiniai ir plaukai, augalų lapai ir sėklos ir kt., naudojami genotipų nustatymui, transgenų, plazmidžių aptikimui, genų išmušimo analizei, DNR šaltinio identifikavimui, rūšių identifikavimui, SNP analizei ir kitose srityse.

Šie laukai turi keletą bendrų bruožų, tai yra, tikslinio geno kiekis yra gana didelis, o nukleino rūgščių ekstrahavimas yra varginantis, todėl tiesioginis PGR gali ne tik sutaupyti laiko ir turėti nedidelę įtaką rezultatams, bet ir sutaupyti išlaidų.

Tiesioginis PGR, naudojamas patogenų aptikimui, yra pastarųjų metų reikalas, kai kurie PGR reagentų gamintojai, kurdami naujoves, įdėjo daug pastangų šia kryptimi.Ypač šios COVID-19 epidemijos metu rinkoje pasirodė daug tokių aptikimo produktų, tokių kaip SARS-CoV-2 nukleino rūgščių aptikimo rinkinys (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method), kurį ištyrė ir sukūrė Foregene, kuris naudoja realaus laiko RT PGR technologiją (rRT-PCR) kokybiniam SARS-2nucle-CoV-CoV-nucleic Acids aptikimui. tepinėlių mėginiai.

„Foregene“ yra viena iš įmonių, naudojančių tiesioginio PGR technologiją normaliam ORF1ab, N, E ir aptikimui.variantas linijos nukleino rūgštys žmogaus nosiaryklės arba burnos ir ryklės tepinėlių mėginiuose, pvz., SARS-CoV-2 B.1.1.7 linija (JK), B.1.351 linija (ZA), B.1.617 linija (IND) ir P.1 linija (BR).

02  Tiesioginei PGR reikalingi reagentai

Lizato mėginys

Mėginio lizatą galite sukonfigūruoti patys arba įsigyti.Skirtingų markių lizato sudėties skirtumai lems skirtingą lizavimo gebėjimą, o lizavimo laikas šiek tiek skirsis.Pavyzdžiui, ruošiant gyvūnų audinių mėginius, paprastai rekomenduojama lizuoti 30 minučių arba per naktį, o virusų lizės tirpalas svyruoja nuo 3 iki 10 minučių.

PGR pagrindinis mišinys

Norint sustiprinti specifinę amplifikaciją ir padidinti amplifikacijos galimybes, rekomenduojama naudoti karšto paleidimo DNR polimerazę.Tiesioginio PGR pagrindas yra labai tolerantiška polimerazė.

Pašalinkite arba slopinkite mėginio komponentus, turinčius įtakos DNR amplifikacijai

Apdorojus mėginį su lizatu, išsiskirs baltymai, lipidai ir kitos ląstelių liekanos, šios medžiagos slopins PGR reakciją.Todėl norint sumažinti šių veiksnių įtaką, atliekant tiesioginį PGR, reikia pridėti atitinkamą pašalinimą arba inhibitorius.

03  Penkių tiesioginio PGR žinių taškų rinkinys

Pirma, tiesioginė PGR technologija yra tiesioginė PGR technologija įvairiems biologiniams mėginiams.Esant tokioms techninėms sąlygoms, PGR reakcijai atlikti nereikia atskirti ir ekstrahuoti nukleino rūgšties, tiesiogiai naudoti audinio mėginį kaip objektą ir pridėti tikslinių genų pradmenų.

Antra, tiesioginė PGR technologija yra ne tik tradicinė DNR šablono amplifikacijos technologija, bet ir RNR šablono atvirkštinės transkripcijos PGR.

Trečia, tiesioginė PGR technologija ne tik tiesiogiai atlieka įprastas kokybines PGR reakcijas su audinių mėginiais, bet ir apima realaus laiko qPCR reakcijas, kurioms reikalinga, kad reakcijos sistema turėtų stiprią antifoninės fluorescencijos trukdžių galimybę, o endogeninė fluorescencija gesina antagonistinį gebėjimą.

Ketvirta, mėginiams, kuriems taikoma tiesioginė PGR technologija, reikia tik atpalaiduoti nukleorūgščių šablonus ir nepašalinti baltymų, polisacharidų, druskų jonų ir kt., kurie trukdo PGR reakcijai.Tam reikia, kad reakcijos sistemoje esanti nukleorūgščių polimerazė ir PGR mišinys turėtų puikų atsparumą ir prisitaikymą, kad būtų užtikrintas fermentų aktyvumas ir replikacijos tikslumas sudėtingomis sąlygomis.

Penkta, audinio mėginys, nukreiptas naudojant tiesioginę PGR technologiją, be jokio nukleino rūgšties sodrinimo apdorojimo ir šablono kiekio yra labai mažas, todėl reakcijos sistema turi būti ypač jautri ir amplifikacijos efektyvumas.