Išskirtinis PGR reakcijos bruožas yra didelis amplifikacijos pajėgumas ir itin didelis jautrumas.Siekdami pagerinti PGR veikimą ir aptikimo efektyvumą, esame įsipareigoję pagerinti PGR amplifikacijos pajėgumą ir aptikimo jautrumą, tačiau galvos skausmas yra eksperimento procese.Dažnai pasitaiko klaidingų teigiamų rezultatų, o labai mažas mėginio kryžminio užteršimo arba PGR produkto užteršimo kiekis gali sukelti klaidingus teigiamus rezultatus eksperimente.
Penki PGR produkto užteršimo tipai
Yra daug PGR užteršimo priežasčių, kurias galima grubiai suskirstyti į šias kategorijas:
Mėginys užterštas daugiausia dėl mėginio surinkimo talpyklos užteršimo arba, kai mėginys dedamas, jis išteka iš talpyklos dėl laisvo sandarinimo arba mėginys yra prilipęs prie konteinerio išorės, o tai sukelia kryžminį užteršimą;Užteršimas sukelia užteršimą tarp mėginių;kai kurie mikrobų mėginiai, ypač virusai, gali plisti su aerozoliais arba sudaryti aerozolius, todėl gali būti abipusiai užteršti.
Pagrindinė priežastis yra ta, kad ruošiant PGR reagentus mėginio pistoletas, talpykla, dvigubai distiliuotas vanduo ir kiti tirpalai yra užteršti PGR nukleorūgščių šablonu.
Molekulinės biologijos laboratorijose ir kai kuriose laboratorijose, kuriose klonuotos plazmidės naudojamos kaip teigiamos kontrolės priemonės, klonuotų plazmidių užteršimo problema taip pat yra dažna.Kadangi klonavimo plazmidės kiekis tūrio vienetuose yra gana didelis, o valymo procese reikia daugiau įrankių ir reagentų, o gyvose ląstelėse esanti plazmidė gali būti užteršta dėl stipraus gyvų ląstelių augimo ir dauginimosi galimybių.
Amplifikuotų produktų užterštumas yra dažniausia užteršimo problema PGR reakcijose.Kadangi PGR produkto kopijų kiekis yra didelis (paprastai 1013 kopijų/ml), kuris yra daug didesnis už PGR aptikimo kopijų skaičiaus ribą, labai mažas PGR produkto užteršimo kiekis gali sukelti klaidingus teigiamus rezultatus.
Aerozolinė tarša yra labiausiai tikėtina PGR produktų užteršimo forma, be to, jos lengviausia nepastebėti.Jis susidaro dėl trinties tarp skysčio paviršiaus ir oro.Paprastai aerozolinis užterštumas gali susidaryti atidarius dangtį, išsiurbus mėginį arba net stipriai purtant reakcijos vamzdelį.Skaičiavimų duomenimis, aerozolio dalelėje gali būti 48 000 kopijų, todėl jos keliama tarša yra problema, kuriai verta skirti ypatingą dėmesį.
Visų pirma, bandymų laboratorijos tam tikram genui tirti dažnai naudoja tą pačią pradmenų porą.Laikui bėgant, laboratorijos erdvėje atsiras didelis kiekis PGR produkto užteršimo.Atsiradus tokiam užteršimui, per trumpą laiką sunku jį pašalinti.
Pirmosioms trims taršos rūšims galime naudoti veiksmingas priemones, kad išvengtume, tačiau PGR produktų sukeliamos taršos išvengti sunku, ypač statant nestandartines PGR laboratorijas.PGR procese, kai pipetės antgalis čiulpia ir pučia skystį, o PGR vamzdelio dangtelis atidaromas, susidaro aerozolis.Aerozolio nešamas DNR molekules (viename aerozolyje gali būti dešimtys tūkstančių DNR) sunku pašalinti, nes jos sklando ore.Įvedus kitą PGR eksperimentų etapą, neišvengiamai atsiras klaidingų teigiamų rezultatų.
Kaip parodyta paveikslėlyje žemiau, neigiama kontrolė taip pat sustiprino atitinkamą dominančią juostą:
Čia pristatoma pirmoji šio PGR taršos ir prevencijos numerio dalis.Kitame numeryje bus pristatyta antroji dalis „PGR produkto užteršimo prevencija“, tad sekite naujienas!
Paskelbimo laikas: 2017-07-25
