Fluorescencinė kiekybinė PGR (taip pat žinoma kaip TaqMan PGR, toliau – FQ-PGR) yra nauja nukleino rūgščių kiekybinė technologija, kurią 1995 m. sukūrė JAV PE (Perkin Elmer). Ši technologija pagrįsta įprastine PGR, pridedant fluorescenciniu būdu pažymėtus zondus.Palyginti su lanksčia PGR, FQ-PGR turi daug pranašumų, kad būtų galima realizuoti savo kiekybinę funkciją.Šiame straipsnyje ketinama trumpai apibūdinti technologijos charakteristikas, principus, metodus ir pritaikymą.
1 Savybės
FQ-PCR pasižymi ne tik dideliu jautrumu kaip įprastas PGR, bet ir dėl fluorescencinių zondų panaudojimo, jis gali tiesiogiai aptikti fluorescencinio signalo pokytį PGR amplifikacijos metu per fotoelektrinio laidumo sistemą, kad gautų kiekybinius rezultatus, kurie pašalina daugelį įprastinės PGR trūkumų, todėl pasižymi dideliu DNR hibridizacijos spektro specifiškumu ir specifiškumu.
Pavyzdžiui, bendrieji PGR produktai turi būti stebimi naudojant agarozės gelio elektroforezę ir dažant etidžio bromidu ultravioletiniais spinduliais arba poliakrilamido gelio elektroforeze ir dažant sidabru.Tam reikia ne tik kelių instrumentų, bet ir laiko bei pastangų.Naudojamos dėmės Etidžio bromidas yra kenksmingas žmogaus organizmui, o šios sudėtingos eksperimentinės procedūros suteikia galimybę užteršti ir gauti klaidingus teigiamus rezultatus.Tačiau FQ-PGR dangtelį reikia atidaryti tik vieną kartą mėginio pakrovimo metu, o tolesnis procesas yra visiškai uždaro vamzdelio veikimas, kuriam nereikia papildomo PGR apdorojimo, todėl išvengiama daugelio įprastų PGR operacijų trūkumų.Eksperimente paprastai naudojamas ABI7100 PCR terminis cikleris, kurį sukūrė PE įmonė.
Prietaisas turi šias charakteristikas: ① Platus pritaikymas: gali būti naudojamas DNR ir RNR PGR produktų kiekybiniam įvertinimui, genų ekspresijos tyrimams, patogenų aptikimui ir PGR sąlygų optimizavimui.② Unikalus kiekybinis principas: naudojant fluorescenciniu būdu pažymėtus zondus, fluorescencijos kiekis kaupsis su PGR ciklu po sužadinimo lazeriu, kad būtų pasiektas kiekybinio įvertinimo tikslas.③ Didelis darbo efektyvumas: įmontuotas 9600 PGR terminis ciklas, kompiuteriu valdomas 1–2 valandas, kad būtų galima automatiškai ir sinchroniškai sustiprinti ir kiekybiškai įvertinti 96 mėginius.④ Nereikia gelio elektroforezės: nereikia skiesti ir elektroforezės mėginio, tiesiog naudokite specialų zondą, kad aptiktumėte tiesiogiai reakcijos mėgintuvėlyje.⑤ Jokios taršos vamzdyne: pritaikytas unikalus visiškai uždaras reakcijos vamzdis ir fotoelektrinio laidumo sistema, todėl nereikia jaudintis dėl taršos.⑥ Rezultatai yra atkuriami: kiekybinis dinaminis diapazonas yra iki penkių dydžių eilučių.Todėl nuo tada, kai ši technologija buvo sėkmingai sukurta, ji buvo vertinama daugelio mokslininkų ir buvo pritaikyta daugelyje sričių.
2 Principai ir metodai
FQ-PGR veikimo principas yra naudoti Taq fermento 5′→3′ egzonukleazės aktyvumą, kad į PGR reakcijos sistemą būtų įtrauktas fluorescenciniu būdu pažymėtas zondas.Zondas gali specifiškai hibridizuotis su pradmenų sekoje esančiu DNR šablonu.5′ zondo galas pažymėtas fluorescencijos emisijos genu FAM (6-karboksifluoresceinas, fluorescencijos emisijos smailė ties 518 nm), o 3′ galas yra pažymėtas Fluorescencijos gesinimo grupė TAMRA (6-karboksitetrametilrodaminas, 5-karboksitetrametilrodamino profluorescencija, 5 fluorescencija8). yra fosforilintas, kad zondas nebūtų pratęstas PGR amplifikacijos metu.Kai zondas lieka nepažeistas, gesinimo grupė slopina skleidžiančios grupės fluorescencinę emisiją.Kai spinduliuojanti grupė yra atskirta nuo gesinimo grupės, slopinimas panaikinamas, o optinis tankis ties 518 nm padidėja ir jį nustato fluorescencijos aptikimo sistema. Renatūracijos fazėje zondas hibridizuojasi su šablono DNR, o pratęsimo fazėje esantis Taq fermentas juda išilgai DNR šablono kartu su pradmens pratęsimu.Kai zondas nupjaunamas, atpalaiduojamas gesinimo efektas ir atleidžiamas fluorescencinis signalas.Kiekvieną kartą, kai nukopijuojamas šablonas, zondas nupjaunamas, kartu paleidžiamas fluorescencinis signalas.Kadangi yra vienas su vienu ryšys tarp išleistų fluoroforų skaičiaus ir PGR produktų skaičiaus, šis metodas gali būti naudojamas tiksliai kiekybiškai įvertinti šabloną.Eksperimentinis prietaisas paprastai naudoja ABI7100 PCR terminį ciklą, kurį sukūrė PE įmonė, taip pat gali būti naudojami kiti termocikleriai.Jei eksperimentui naudojama ABI7700 reakcijos tipo reakcijų sistema, pasibaigus reakcijai, kiekybiniai rezultatai gali būti tiesiogiai pateikiami atliekant kompiuterinę analizę.Jei naudojate kitus terminius ciklerius, turite naudoti fluorescencijos detektorių, kad tuo pačiu metu išmatuotų fluorescencijos signalą reakcijos vamzdyje, kad apskaičiuotumėte RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ reiškia mėginio mėgintuvėlio fluorescencinės emisijos grupės liuminescencijos intensyvumo santykį su gesinimo grupės liuminescencijos intensyvumu, RQ- reiškia dviejų santykį tuščiame mėgintuvėlyje, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) reiškia gautų rezultatų kiekį po fluorescencinio signalo pasikeitimo, apdorojant fluorescencinius duomenis.Dėl fluorescencinių zondų įvedimo eksperimento specifiškumas žymiai pagerėja.Zondo konstrukcija paprastai turi atitikti šias sąlygas: ①Zondo ilgis turi būti apie 20–40 bazių, kad būtų užtikrintas surišimo specifiškumas.②GC bazių kiekis yra nuo 40% iki 60%, kad būtų išvengta pavienių nukleotidų sekų dubliavimo.③ Venkite hibridizacijos arba persidengimo su pradmenimis.④ Ryšio tarp zondo ir šablono stabilumas yra didesnis nei surišimo tarp pradmens ir šablono stabilumas, todėl zondo Tm vertė turi būti bent 5°C didesnė už pradmens Tm vertę.Be to, zondo koncentracija, zondo ir šablono sekos homologija bei atstumas tarp zondo ir pradmens turi įtakos eksperimento rezultatams.
Susiję produktai:
Kinijos realaus laiko PCR Easyᵀᴹ-Taqman gamintojas ir tiekėjas |Foregene (foreivd.com)
Paskelbimo laikas: 2021-10-15
