Molekulinės diagnostikos technologijoje naudojami molekulinės biologijos metodai, skirti aptikti žmogaus kūno genetinės medžiagos ir įvairių patogenų raišką ir struktūrą, kad būtų pasiektas ligų prognozavimo ir diagnozavimo tikslas.

Pastaraisiais metais, tobulėjant ir kartojantis molekulinės diagnostikos technologijas, molekulinės diagnostikos klinikinis pritaikymas tapo vis platesnis ir gilesnis, o molekulinės diagnostikos rinka įžengė į spartaus vystymosi laikotarpį.

Autorius apibendrina rinkoje paplitusias molekulinės diagnostikos technologijas, suskirstytas į tris dalis: pirmoji dalis supažindina su PGR technologija, antroji dalis supažindina su nukleorūgščių izoterminio amplifikacijos technologija, o antroje – su sekos nustatymo technologija.

01

I dalis: PGR technologija

PGR technologija

PGR (polimerazės grandininė reakcija) yra viena iš in vitro DNR amplifikacijos technologijų, turinti daugiau nei 30 metų istoriją.

PGR technologijos pradininkas 1983 m. buvo Kary Mullis iš Cetus, JAV.Mullis kreipėsi dėl PGR patento 1985 m. ir tais pačiais metais paskelbė pirmąjį PGR akademinį darbą apie mokslą.Mullis gavo Nobelio chemijos premiją 1993 m.

Pagrindiniai PGR principai

PGR gali amplifikuoti tikslinius DNR fragmentus daugiau nei vieną milijoną kartų.Principas yra tas, kad katalizuojant DNR polimerazei pagrindinė DNR grandinė yra naudojama kaip šablonas, o specifinis pradmuo naudojamas kaip pradinis pratęsimo taškas.Jis atkartojamas in vitro atliekant tokius veiksmus kaip denatūravimas, atkaitinimas ir pratęsimas.Dukterinės grandinės DNR, kuri papildo pagrindinės grandinės šablono DNR, procesas.

Standartinis PGR procesas yra padalintas į tris etapus:

1. Denatūravimas: DNR dviguboms grandinėms atskirti naudokite aukštą temperatūrą.Vandeniliniai ryšiai tarp DNR dvigubų grandžių nutrūksta aukštoje temperatūroje (93-98°C).

2. Atkaitinimas: Atskyrus dvigrandę DNR, temperatūra sumažinama, kad pradmenys galėtų prisijungti prie vienos grandinės DNR.

3. Pratęsimas: DNR polimerazė pradeda sintetinti papildomas grandines išilgai DNR grandžių iš pradmenų, surištų, kai temperatūra nukrenta.Kai pratęsimas baigiamas, ciklas baigiamas ir DNR fragmentų skaičius padvigubėja.

Šiuos tris etapus 25-35 kartus pakartojus, DNR fragmentų skaičius padidės eksponentiškai.

PGR išradingumas yra tas, kad skirtingi pradmenys gali būti sukurti skirtingiems tiksliniams genams, kad tikslinio geno fragmentus būtų galima amplifikuoti per trumpą laiką.

Kol kas PGR galima suskirstyti į tris kategorijas, būtent įprastą PGR, fluorescencinę kiekybinę PGR ir skaitmeninę PGR.

Pirmoji įprasto PGR karta

Norėdami amplifikuoti tikslinį geną, naudokite įprastą PGR amplifikacijos instrumentą, o tada naudokite agarozės gelio elektroforezę produktui aptikti. Galima atlikti tik kokybinę analizę.

Pagrindiniai pirmosios kartos PGR trūkumai:

-Polinkis į nespecifinį amplifikaciją ir klaidingai teigiamus rezultatus.

-Aptikimas užtrunka ilgai, o operacija yra sudėtinga.

- Galima atlikti tik kokybinius testus.

Antros kartos fluorescencinė kiekybinė PGR

Fluorescencinė kiekybinė PGR (realaus laiko PGR), taip pat žinoma kaip qPCR, naudojama stebėti amplifikuotų produktų kaupimąsi kaupiant fluorescencinius signalus, pridedant fluorescencinius zondus, kurie gali rodyti reakcijos sistemos eigą, ir įvertinti rezultatus pagal fluorescencijos kreivę.

Kadangi qPCR technologija vykdoma uždaroje sistemoje, sumažėja užteršimo tikimybė, o fluorescencinis signalas gali būti stebimas kiekybiniam aptikimui, todėl ji yra plačiausiai naudojama klinikinėje praktikoje ir tapo dominuojančia PGR technologija.

Fluorescencinės medžiagos, naudojamos realaus laiko fluorescencinėje kiekybinėje PGR, gali būti suskirstytos į: TaqMan fluorescencinius zondus, molekulinius švyturius ir fluorescencinius dažus.

1) TaqMan fluorescencinis zondas:

PGR amplifikacijos metu pridedamas specifinis fluorescencinis zondas, pridedant porą pradmenų.Zondas yra oligonukleotidas, o abu galai yra atitinkamai pažymėti reporterio fluorescencine grupe ir gesinimo fluorescencine grupe.

Kai zondas nepažeistas, reporterių grupės skleidžiamą fluorescencinį signalą sugeria gesinimo grupė;PGR amplifikacijos metu Taq fermento 5′-3′ egzonukleazės aktyvumas suskaido ir suardo zondą, todėl reporterio fluorescencinė grupė ir gesintuvas. Fluorescencinė grupė yra atskirta, kad fluorescencijos stebėjimo sistema galėtų priimti fluorescencijos signalą, t. yra visiškai sinchronizuotas su PGR produkto susidarymu.

2) SYBR fluorescenciniai dažai:

PGR reakcijos sistemoje pridedamas SYBR fluorescencinio dažiklio perteklius.Po to, kai SYBR fluorescenciniai dažai yra nespecifiškai įtraukiami į DNR dvigubą grandinę, jis skleidžia fluorescencinį signalą.SYBR dažų molekulė, kuri nėra įtraukta į grandinę, neskleis jokio fluorescencinio signalo, taip užtikrinant fluorescencinį signalą. PGR produktų padidėjimas yra visiškai sinchronizuojamas su PGR produktų padidėjimu.SYBR jungiasi tik su dvigrandės DNR, todėl pagal lydymosi kreivę galima nustatyti, ar PGR reakcija yra specifinė.

3) Molekuliniai švyturiai

Tai yra stiebo kilpa, dvigubai pažymėtas oligonukleotidinis zondas, kuris sudaro maždaug 8 bazių plaukų segtuko struktūrą 5 ir 3 galuose.Nukleino rūgščių sekos abiejuose galuose yra komplementariai suporuotos, todėl fluorescencinė grupė ir gesinimo grupė yra sandarios.Uždarykite, jis nesukels fluorescencijos.

Sukūrus PGR produktą, atkaitinimo proceso metu vidurinė molekulinio švyturio dalis suporuojama su specifine DNR seka, o fluorescencinis genas atskiriamas nuo gesinimo geno, kad susidarytų fluorescencija.

Pagrindiniai antrosios kartos PGR trūkumai:

Jautrumo vis dar trūksta, o mažos kopijos mėginių aptikimas nėra tikslus.

Yra foninės vertės įtaka, o rezultatas yra jautrus trukdžiams.

Trečiosios kartos skaitmeninis PGR

Skaitmeninis PGR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) apskaičiuoja tikslinės sekos kopijų skaičių, aptikdamas galutinį tašką, ir gali atlikti tikslų absoliučią kiekybinį aptikimą nenaudodamas vidinių kontrolės priemonių ir standartinių kreivių.

Skaitmeninė PGR naudoja galutinio taško aptikimą ir nepriklauso nuo Ct vertės (ciklo slenksčio), todėl skaitmeninę PGR reakciją mažiau veikia amplifikacijos efektyvumas, pagerėja tolerancija PGR reakcijos inhibitoriams, pasižymi dideliu tikslumu ir atkuriamumu.

Dėl didelio jautrumo ir didelio tikslumo savybių PGR reakcijos inhibitoriai lengvai netrukdo ir gali pasiekti tikrą absoliutų kiekį be standartinių produktų, kurie tapo tyrimų ir taikymo tašku.

Pagal skirtingas reakcijos vieneto formas jį galima suskirstyti į tris tipus: mikroskysčių, lustų ir lašelių sistemas.