Klausos praradimas (HL) yra dažniausia žmonių jutimo sutrikimų liga.Išsivysčiusiose šalyse apie 80% vaikų ikikalbinio kurtumo atvejų sukelia genetiniai veiksniai.Dažniausi yra vieno geno defektai (kaip parodyta 1 pav.), 124 genų mutacijos buvo susijusios su nesindrominiu žmogaus klausos praradimu, likusias sukelia aplinkos veiksniai.Kochlearinis implantas (elektroninis prietaisas, dedamas į vidinę ausį, kuris elektros stimuliuoja tiesiai į klausos nervą) yra pats veiksmingiausias būdas gydyti sunkią HL, o klausos aparatas (išorinis elektroninis prietaisas, konvertuojantis ir stiprinantis garso bangas) gali padėti pacientams, sergantiems vidutinio sunkumo HL.Tačiau šiuo metu nėra vaistų, skirtų paveldimai HL (GHL) gydyti.Pastaraisiais metais genų terapijai skiriama vis daugiau dėmesio kaip perspektyviam vidinės ausies disfunkcijos gydymo metodui.

1 pav.Su kurtumu susijusių variacijų pasiskirstymas.[1]

Neseniai mokslininkai iš Salko instituto ir Šefildo universiteto paskelbė tyrimo rezultatą molekulinėje terapijoje – metodai ir klinikinė plėtra [2], kurie parodė plačias paveldimo kurtumo in vivo genų terapijos taikymo perspektyvas.Uri Manoras, Salko instituto mokslinio tyrimo profesoriaus asistentas ir Waitt pažangiosios biofotonikos centro direktorius, sakė, kad jis gimė su dideliu klausos praradimu ir manė, kad klausos atkūrimas būtų nuostabi dovana.Ankstesni jo tyrimai parodė, kad Eps8 yra aktiną reguliuojantis baltymas, turintis aktiną surišančio ir ribojimo veiklą;kochlearinėse plaukų ląstelėse baltymų kompleksas, kurį sudaro Eps8 su MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 ir GNAI3, daugiausia egzistuoja. Plaukų ryšulių priežiūrai reikalingi ilgų stereocilijų galiukai, kurie kartu su MYO15A lokalizuoja BAIAP2L2 ties trumpesnių stereocilijų galiukais.Todėl Eps8 gali reguliuoti plaukų ląstelių stereocilijų ilgį, o tai būtina normaliai klausos funkcijai;Eps8 ištrynimas arba mutacija sukels trumpas stereocilijas, dėl kurių jis negalės tinkamai paversti garso į elektrinius signalus, skirtus smegenų suvokimui, o tai savo ruožtu sukelia kurtumą..Tuo pačiu metu bendradarbis Walteris Marcotti, Šefildo universiteto profesorius, nustatė, kad plaukų ląstelės negali normaliai vystytis, jei nėra Eps8.Šiame tyrime Manor ir Marcotti susivienijo, kad ištirtų, ar Eps8 pridėjimas prie stereociliarinių ląstelių gali atkurti jų funkciją ir, savo ruožtu, pagerinti pelių klausą.Tyrėjų grupė panaudojo adeno-associated virus (AAV) vektorių Anc80L65, kad į Eps8-/- naujagimių P1-P2 pelių sraigę, apvalaus lango membranos injekcija, būtų pristatyta koduojanti seka, kurioje yra laukinio tipo EPS8;pelių kochlearinėse plaukų ląstelėse Stereocilijų funkcija buvo pataisyta jiems nesubrendus;o taisymo efektas pasižymėjo vaizdo gavimo technologija ir stereocilijų matavimu.Rezultatai parodė, kad Eps8 padidino stereocilijų ilgį ir atkūrė plaukų ląstelių funkciją žemo dažnio ląstelėse.Jie taip pat nustatė, kad laikui bėgant ląstelės prarado gebėjimą būti išgelbėtos taikant šią genų terapiją.Tai reiškia, kad šį gydymą gali tekti skirti gimdoje, nes Eps8-/- plaukų ląstelės gali būti subrendusios arba susikaupusios nepataisomos žalos po pelių gimimo.„Eps8 yra baltymas, turintis daug skirtingų funkcijų, ir dar reikia daug ką ištirti“, – sakė Manoras.Būsimi tyrimai apims Eps8 genų terapijos poveikio atkuriant klausą įvairiuose vystymosi etapuose tyrimą ir ar gali būti įmanoma pratęsti gydymo galimybes.Atsitiktinai 2020 m. lapkritį profesorius KarenB Avrahamas iš Tel Avivo universiteto Izraelyje paskelbė savo rezultatus žurnale EMBO Molecular Medicine [3], naudodamas novatorišką genų terapijos technologiją, kad sukurtų nekenksmingą sintetinį adeno susijusį virusą AAV9-PHP.B, Syne4-/- pelių plaukų ląstelių geno defektas buvo ištaisytas į pelių vidinę ausį suleidus virusą, turintį Syne4 koduojančią seką, leidžiant jam patekti į plaukų ląsteles ir išlaisvinti perneštą genetinę medžiagą, leidžiančią joms bręsti ir normaliai funkcionuoti (kaip parodyta 2 pav.).

2 pav.Scheminis vidinės ausies anatomijos vaizdas, daugiausia dėmesio skiriant Corti organui ir nesprin-4 ląstelių funkcijai.

Matyti, kad genų terapijos panaudojimas siekiant tikslo gydyti paveldimas ligas genų lygmeniu, įterpiant, pašalinant ar koreguojant bet kokius mutavusius genus gydymui (tai yra kontroliuojant genetinius ligos pokyčius), turi didelį klinikinį efektą.taikymo perspektyvas.Šiuolaikinius genų terapijos metodus, skirtus genetiškai nepakankamam kurtumui, galima suskirstyti į šias kategorijas:

genų pakeitimas

Genų pakeitimas, be abejo, yra „paprastiausia“ genų terapijos forma, pagrįsta defektinio geno identifikavimu ir pakeitimu normalia arba laukinio tipo geno kopija.Pirmasis sėkmingas vidinės ausies genų terapijos tyrimas dėl klausos praradimo, kurį sukėlė vezikulinio glutamato transporterio 3 (VGLUT3) geno ištrynimas;AAV1 sukeltas egzogeninės VGLUT3 ekspresijos perteklius vidinės ausies plaukų ląstelėse (IHC) Gali sukelti ilgalaikį klausos atsigavimą, dalinį juostelės sinapsinės morfologijos atkūrimą ir traukulius [4].Tačiau pavyzdžiuose, įskaitant du AAV pateiktus genų pakaitalus, aprašytus pirmiau įžangoje, svarbu pažymėti, kad pelių modeliai, naudojami tam tikrų tipų genų ištrynimo paveldimo klausos praradimo sutrikimams gydyti, laikinai skiriasi nuo žmonių, o P1 pelių vidinė ausis yra subrendusioje vystymosi stadijoje.Priešingai, žmonės gimsta su subrendusia vidine ausimi.Šis skirtumas neleidžia pritaikyti pelių rezultatų gydant žmogaus paveldimus kurtumo sutrikimus, nebent genų terapija būtų taikoma subrendusioms pelių ausims.

Genų redagavimas: CRISPR / Cas9

Palyginti su „genų pakeitimu“, genų redagavimo technologijos plėtra atnešė genetinių ligų gydymo pradžią.Svarbu tai, kad genų redagavimo metodas kompensuoja tradicinių pernelyg didelės ekspresijos genų terapijos metodų trūkumus, kurie netinka dominuojančioms paveldimoms kurtumo ligoms, ir problemą, kad pernelyg didelės ekspresijos metodas trunka neilgai.Kinijos mokslininkams specialiai išmušus Myo6C442Y mutantinį alelį Myo6WT/C442Y pelėse, naudojant AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2 genų redagavimo sistemą, ir per 5 mėnesius nuo išmušimo, pelės Modelio klausos funkcija buvo atkurta;kartu taip pat pastebėta, kad vidinėje ausyje pagerėjo plaukuotųjų ląstelių išgyvenamumas, blakstienų forma tapo taisyklinga, koreguojami elektrofiziologiniai rodikliai [5].Tai pirmasis tyrimas pasaulyje, kuriame naudojama CRISPR/Cas9 technologija, skirta gydyti Myo6 genų mutacijos sukeltą paveldimą kurtumą, ir tai yra svarbi genų redagavimo technologijos, skirtos paveldimo kurtumo gydymui, tyrimų pažanga.Klinikinis gydymo vertimas suteikia tvirtą mokslinį pagrindą.

Genų terapijos pristatymo metodai

Kad genų terapija būtų sėkminga, plika DNR molekulės negali efektyviai prasiskverbti į ląsteles dėl savo hidrofiliškumo ir neigiamo fosfatų grupių krūvio, o norint užtikrinti papildytų nukleorūgščių molekulių vientisumą, reikia parinkti saugų ir efektyvų metodą.Papildyta DNR pristatoma į tikslinę ląstelę ar audinį.Dėl didelio infekcinio poveikio, mažo imunogeniškumo ir plataus tropizmo įvairiems audinių tipams AAV yra plačiai naudojamas kaip pristatymo priemonė ligoms gydyti.Šiuo metu daugybė mokslinių tyrimų nustatė skirtingų AAV potipių tropizmą, palyginti su skirtingais pelių sraigės ląstelių tipais.Naudojant AAV pristatymo charakteristikas kartu su ląstelėms būdingais promotoriais, galima pasiekti specifinę ląstelei būdingą ekspresiją, kuri gali sumažinti netikslinį poveikį.Be to, kaip alternatyva tradiciniams AAV vektoriams, nuolat kuriami nauji sintetiniai AAV vektoriai, pasižymintys puikiu transdukcijos gebėjimu vidinėje ausyje, iš kurių AAV2/Anc80L65 yra plačiausiai naudojamas.Nevirusinius pristatymo būdus galima dar skirstyti į fizikinius (mikroinjekcija ir elektroporacija) ir cheminius (lipidų, polimerų ir aukso nanodalelių pagrindu pagamintus metodus).Abu metodai buvo naudojami gydant paveldimus kurtumo sutrikimus ir parodė skirtingus privalumus bei apribojimus.Be įvedimo nešiklio genų terapijai kaip nešiklio, gali būti taikomi skirtingi in vivo genų įvedimo būdai, atsižvelgiant į skirtingus tikslinių ląstelių tipus, vartojimo būdus ir terapinį veiksmingumą.Dėl sudėtingos vidinės ausies struktūros sunku pasiekti tikslines ląsteles, o genomo redagavimo agentų pasiskirstymas yra lėtas.Plėvinis labirintas yra smilkininio kaulo kauliniame labirinte ir apima kochlearinį lataką, pusapvalį lataką, utrikulą ir balioną.Jo santykinė izoliacija, minimali limfos cirkuliacija ir kraujo atskyrimas nuo kraujo labirinto barjeru riboja veiksmingą sisteminį terapinių preparatų tiekimą tik naujagimių pelėms.Norint gauti genų terapijai tinkamus viruso titrus, būtina tiesioginė vietinė virusinių vektorių injekcija į vidinę ausį.Nustatyti injekcijos būdai: [6]: (1) apvalaus lango membrana (RWM), (2) tracheostomija, (3) endolimfatinė arba perilimfinė kochleostomija, (4) apvalaus lango membrana ir vamzdelio fenestracija (CF) (kaip parodyta 3 pav.).

3 pav.Genų terapijos pristatymas vidinėje ausyje.

Nors genų terapijoje padaryta daug pažangos, remiantis klinikiniais transliacijos tikslais, reikia nuveikti daugiau, kad genų terapija taptų pirmos eilės gydymo būdu pacientams, sergantiems genetinėmis ligomis, ypač kuriant saugius ir veiksmingus vektorius ir pristatymo metodą.Tačiau mes tikime, kad netolimoje ateityje tokie gydymo būdai taps pagrindine personalizuotos terapijos dalimi ir turės labai teigiamą poveikį genetinių sutrikimų turinčių žmonių ir jų šeimų gyvenimui.

„Foregene“ taip pat išleido didelio našumo tikslinių genų patikros rinkinį, kuris yra greitas ir gali atlikti atvirkštinės transkripcijos ir qPCR reakcijas be RNR ekstrahavimo.

Produktų nuorodos

Cell Direct RT-qPCR rinkinys – Taqman/SYBR GREEN I

Norėdami gauti daugiau informacijos apie produktą, kreipkitės:

overseas@foregene.com