Ct vertė yra svarbiausia fluorescencinės kiekybinės PGR rezultatų pateikimo forma.Jis naudojamas genų ekspresijos skirtumams arba genų kopijų skaičiui apskaičiuoti.Taigi kokia yra fluorescencijos kiekybinio nustatymo Ct vertė, laikoma pagrįsta?Kaip užtikrinti efektyvų Ct vertės diapazoną?
Kas yra Ct vertė?
qPCR stiprinimo proceso metu atitinkamas stiprinimo ciklų skaičius (Cycle Threshold), kai sustiprinto produkto fluorescencinis signalas pasiekia nustatytą fluorescencijos slenkstį.C reiškia ciklą, o T reiškia slenkstį.Paprasčiau tariant, Ct reikšmė yra ciklų skaičius, atitinkantis, kada pradinis šablono amplifikavimas pasiekia tam tikrą produkto kiekį qPCR.Vadinamasis „tam tikras produkto kiekis“ bus išsamiau paaiškintas vėliau.
Ką daro Ct vertė?
1. Ryšys tarp eksponentinės amplifikacijos, šablono kiekio ir Ct vertės
Idealiu atveju qPCR genai kaupiami eksponentinės amplifikacijos būdu po tam tikro ciklų skaičiaus.Ryšys tarp stiprinimo ciklų skaičiaus ir produktų kiekio yra toks: Sustiprinto produkto kiekis = pradinis šablono kiekis × (1+En) ciklų skaičius.Tačiau qPCR reakcija ne visada yra ideali situacija.Kai sustiprinto produkto kiekis pasiekia „tam tikrą produkto kiekį“, ciklų skaičius šiuo metu yra Ct vertė ir jis yra eksponentinės amplifikacijos periode.Ryšys tarp Ct reikšmės ir pradinio šablono kiekio: yra tiesinis ryšys tarp šablono Ct reikšmės ir šablono pradinio kopijos numerio logaritmo.Kuo didesnė pradinė šablono koncentracija, tuo mažesnė Ct reikšmė;kuo mažesnė pradinė šablono koncentracija, tuo didesnė Ct reikšmė.
2. Amplifikacijos kreivė, fluorescencijos slenkstis ir tam tikras PGR produkto kiekis
qPCR amplifikacijos produkto kiekis tiesiogiai pateikiamas fluorescencinio signalo, tai yra, amplifikacijos kreivės, forma.Ankstyvoje PGR stadijoje amplifikacija vyksta idealiomis sąlygomis, ciklų skaičius mažas, produkto kaupimasis mažas, o fluorescencijos lygio negalima aiškiai atskirti nuo fluorescencinio fono.Po to fluorescencija didėja ir pereina į eksponentinę fazę.PGR produkto kiekis gali būti aptiktas tam tikru momentu, kai PGR reakcija yra tik eksponentinėje fazėje, kuri gali būti naudojama kaip „tam tikras produkto kiekis“, ir iš to galima nustatyti pradinį šablono turinį.Todėl fluorescencijos signalo intensyvumas, atitinkantis tam tikrą produkto kiekį, yra fluorescencijos slenkstis.
Vėlyvoje PGR stadijoje amplifikacijos kreivė neberodo eksponentinės amplifikacijos ir patenka į tiesinę fazę ir plato fazę.
3.Ct verčių atkuriamumas
Kai PGR ciklas pasiekia Ct vertės ciklo numerį, jis ką tik įžengė į tikrąjį eksponentinės amplifikacijos periodą.Šiuo metu maža paklaida nebuvo sustiprinta, todėl Ct reikšmės atkuriamumas yra puikus, tai yra, tas pats šablonas yra sustiprinamas skirtingu laiku arba skirtinguose vamzdeliuose tuo pačiu metu.Stiprinimas, gauta Ct reikšmė pastovi.
1.Amplifikacijos efektyvumas En
PGR amplifikacijos efektyvumas reiškia efektyvumą, kuriuo polimerazė paverčia amplifikuojamą geną į amplikoną.Amplifikacijos efektyvumas, kai viena DNR molekulė transformuojama į dvi DNR molekules, yra 100%.Amplifikacijos efektyvumas paprastai išreiškiamas En.Siekiant palengvinti tolesnių straipsnių analizę, trumpai pristatomi stiprinimo efektyvumą įtakojantys veiksniai.
| Įtakojantys veiksniai | paaiškinimas | Kaip teisti? |
| A. PGR inhibitoriai | 1. Šablono DNR yra PGR reakciją slopinančių medžiagų, tokių kaip baltymai arba plovikliai.2. cDNR po atvirkštinės transkripcijos yra didelė matricinės RNR arba RT reagento komponentų koncentracija, kuri taip pat gali slopinti tolesnę PGR reakciją. | 1. Ar yra tarša, galima spręsti išmatavus A260/A280 ir A260/A230 santykį arba RNR elektroforezę.2. Ar po atvirkštinės transkripcijos cDNR atskiesta pagal tam tikrą santykį. |
| B. Netinkamas grunto dizainas | Gruntai nėra efektyviai atkaitinami | Patikrinkite, ar gruntuose nėra pradmenų-dimerų ar plaukų segtukų, neatitikimų ir kartais apimančių vidinius dizainus. |
| C. Netinkamas PGR reakcijos programos sudarymas | 1. Gruntai negali efektyviai atkaitinti2. Nepakankamas DNR polimerazės išsiskyrimas 3. Sumažėjo ilgalaikės aukštos temperatūros DNR polimerazės aktyvumas | 1. Atkaitinimo temperatūra yra aukštesnė už grunto TM reikšmę2. Per trumpas išankstinio denatūravimo laikas 3. Kiekvieno reakcijos procedūros etapo laikas yra per ilgas |
| D. Nepakankamas reagentų maišymas arba pipetavimo klaidos | Reakcijos sistemoje vietinė PGR reakcijos komponentų koncentracija yra per didelė arba netolygi, todėl PGR amplifikacija didėja neeksponentiškai. | |
| E. Amplikono ilgis | Amplikono ilgis yra per ilgas, viršija 300 bp, o stiprinimo efektyvumas yra mažas | Patikrinkite, ar amplikono ilgis yra 80–300 bp |
| F. qPCR reagentų įtaka | DNR polimerazės koncentracija reagente yra maža arba jonų koncentracija buferyje nėra optimizuota, todėl Taq fermento aktyvumas nepasiekia maksimalaus. | Stiprinimo efektyvumo nustatymas standartine kreive |
2.Ct verčių diapazonas
Ct reikšmės svyruoja nuo 15-35.Jei Ct vertė yra mažesnė nei 15, laikoma, kad stiprinimas yra pradinio laikotarpio ribose, o fluorescencijos slenkstis nepasiektas.Idealiu atveju yra tiesinis ryšys tarp Ct reikšmės ir šablono pradinio kopijos numerio logaritmo, ty standartinės kreivės.Per standartinę kreivę, kai amplifikacijos efektyvumas yra 100%, apskaičiuota Ct vertė, skirta kiekybiškai įvertinti geno vienos kopijos skaičių, yra apie 35. Jei jis didesnis nei 35, pradinis šablono kopijos skaičius teoriškai yra mažesnis nei 1, o tai gali būti laikoma beprasmiška.
Skirtingiems genų Ct diapazonams dėl genų kopijų skaičiaus ir amplifikacijos efektyvumo skirtumo pradiniame šablono kiekyje būtina sudaryti standartinę geno kreivę ir apskaičiuoti tiesinį geno aptikimo diapazoną.
3.Ct reikšmę įtakojantys veiksniai
Iš ryšio tarp amplifikacijos ciklų skaičiaus ir produkto kiekio: sustiprinto produkto kiekis = pradinio šablono kiekis × (1 + En) ciklo skaičius, matyti, kad idealiomis sąlygomis pradinio šablono kiekis ir En turės neigiamą poveikį Ct vertei.Dėl šablono kokybės ar stiprinimo efektyvumo skirtumo Ct reikšmė bus per didelė arba per maža.
4.Ct reikšmė per didelė arba per maža
Paskelbimo laikas: 2023-02-22
