Realaus laiko PGR, taip pat žinomas kaip kiekybinis PGR arba qPGR, yra PGR amplifikacijos produktų stebėjimo ir analizės realiuoju laiku metodas.
Kadangi kiekybinis PGR turi paprasto veikimo, greito ir patogaus, didelio jautrumo, gero pakartojamumo ir mažo užteršimo greičio pranašumus, jis plačiai naudojamas atliekant medicininius tyrimus, vaistų veiksmingumo vertinimą, genų ekspresijos tyrimus, transgeninius tyrimus, genų aptikimą, patogenų aptikimą, gyvūnų ir augalų aptikimą., maisto tyrimų ir kitose srityse.
Todėl nesvarbu, ar užsiimate fundamentiniais gyvybės mokslų tyrimais, ar farmacijos įmonių, gyvulininkystės įmonių, maisto įmonių darbuotojai, ar net įvežimo-išvežimo tikrinimo ir karantino biurų, aplinkos stebėjimo skyrių, ligoninių ir kitų padalinių darbuotojai, daugiau ar mažiau susidursite su Ar jums reikia žinoti kiekybinės PGR įsisavinimo žinias.

Realaus laiko PGR principas

Realiojo laiko PGR – tai metodas, kai į PGR reakcijos sistemą pridedamos fluorescencinės medžiagos, o fluorescencinio signalo intensyvumas PGR reakcijos procese realiu laiku stebimas kiekybiniu PGR prietaisu, galiausiai analizuojami ir apdorojami eksperimentiniai duomenys.

【Amplifikacijos kreivė】yra kreivė, apibūdinanti dinaminį PGR procesą.PGR amplifikacijos kreivė iš tikrųjų nėra standartinė eksponentinė kreivė, o sigmoidinė kreivė.

[Amplifikacijos kreivės platformos fazė]Didėjant PGR ciklų skaičiui, inaktyvuojant DNR polimerazei, mažėjant dNTP ir pradmenų kiekiui, o sintezės reakciją slopinant reakcijos šalutiniu produktu pirofosfatu ir kt., PGR ne visada plečiasi eksponentiškai., ir galiausiai pateks į plynaukštę.

[Amplifikacijos kreivės eksponentinio augimo sritis]Nors plokščiakalnio fazė labai skiriasi, tam tikroje amplifikacijos kreivės eksponentinės augimo srities srityje pakartojamumas yra labai geras, o tai labai svarbu atliekant kiekybinę PGR analizę.

[Slenkstinė vertė ir Ct vertė]Fluorescencijos aptikimo ribinę vertę nustatome atitinkamoje amplifikacijos kreivės eksponentinės augimo srities vietoje, ty slenkstinę vertę (Threshold).Slenkstinės vertės ir stiprinimo kreivės susikirtimo taškas yra Ct reikšmė, tai yra, Ct reikšmė nurodo ciklų skaičių (slenksčio ciklas), kai pasiekiama slenkstinė vertė.

Toliau pateiktame grafike aiškiai parodytas ryšys tarp slenksčio linijos ir stiprinimo kreivės, slenksčio ir Ct vertės.

【Kaip kiekybiškai įvertinti?】

Matematinė teorija įrodė, kad Ct reikšmė turi atvirkštinį tiesinį ryšį su pradinių šablonų skaičiaus logaritmu.Realiojo laiko PGR stebi PGR amplifikacijos produktus realiu laiku ir kiekybiškai įvertina juos eksponentinės amplifikacijos fazės metu.

Kiekvieno PGR ciklo metu DNR eksponentiškai padidėjo 2 kartus ir netrukus pasiekė plokščiakalnį.

Darant prielaidą, kad pradinės DNR kiekis yra A₀ , po n ciklų, teorinis DNR produkto kiekis gali būti išreikštas taip:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Tada kuo didesnis pradinis DNR kiekis A 0, tuo greičiau amplifikuoto produkto kiekis pasiekia aptikimo reikšmę An, o ciklų skaičius pasiekus An yra Ct reikšmė.Tai yra, kuo didesnis pradinis DNR kiekis A 0, tuo anksčiau pasiekia amplifikacijos kreivės piką ir atitinkamai reikiamas ciklų skaičius n yra mažesnis.

Mes atliekame žinomos koncentracijos standarto gradientinį praskiedimą ir naudojame jį kaip realaus laiko PGR šabloną, o amplifikacijos kreivių serija bus gauta vienodais intervalais pagal pradinį DNR kiekį nuo didesnio iki mažesnio.Pagal tiesinį ryšį tarp Ct reikšmės ir pradinių šablonų skaičiaus logaritmo, a[standartinė kreivė] galima sukurti .

Pakeitus nežinomos koncentracijos mėginio Ct vertę į standartinę kreivę, galima gauti pradinį nežinomos koncentracijos mėginio šablono kiekį, o tai yra kiekybinis realaus laiko PGR principas.

Realaus laiko PGR aptikimo metodas

Realaus laiko PGR aptinka PGR amplifikacijos produktus, aptikdamas fluorescencijos intensyvumą reakcijos sistemoje.

Fluorescencinių dažų įterpimo metodo principas】

Fluorescenciniai dažai, pvz., TB Green®, PGR sistemose gali nespecifiškai prisijungti prie dvigrandinės DNR ir prisijungus fluorescuoti.

Fluorescencijos intensyvumas reakcijos sistemoje padidėjo eksponentiškai, didėjant PGR ciklams.Nustatant fluorescencijos intensyvumą, DNR amplifikacijos kiekis reakcijos sistemoje gali būti stebimas realiu laiku, o tada pradinio šablono kiekis mėginyje gali būti įvertintas atvirkščiai.

【Fluorescencinio zondo metodo principas】

fluorescencinis zondasyra nukleorūgščių seka su fluorescencine grupe 5′ gale ir gesinimo grupe 3′ gale, kuri gali specifiškai prisijungti prie šablono.Kai zondas yra nepažeistas, fluoroforo skleidžiamą fluorescenciją užgesina gesinimo grupė ir ji negali fluorescuoti.Kai zondas suskaidomas, fluorescencinė medžiaga išsiskirs ir skleis fluorescenciją.

Į PGR reakcijos tirpalą pridedamas fluorescencinis zondas.Atkaitinimo proceso metu fluorescencinis zondas prisijungs prie konkrečios šablono padėties.Prailginimo proceso metu PGR fermento 5′ → 3′ egzonukleazės aktyvumas gali suskaidyti su šablonu hibridizuotą fluorescencinį zondą, o fluorescencinė medžiaga yra atskirta, kad išskirtų fluorescenciją.Nustačius zondo fluorescencijos intensyvumą reakcijos sistemoje, galima pasiekti tikslą stebėti PGR produkto amplifikacijos kiekį.

【Fluorescencijos aptikimo metodo pasirinkimas】

Jei jis naudojamas atskirti sekas, turinčias didelę homologiją, ir atlikti daugialypį PGR aptikimą, pvz., SNP tipavimo analizę, fluorescencinio zondo metodas yra nepakeičiamas.
Kitiems realaus laiko PGR eksperimentams galima naudoti paprastą, lengvą ir nebrangų fluorescencinės chimeros metodą.

zondaiStiprus specifiškumas, galintis atlikti multipleksinę PGR

Trūkumas

Aukšti stiprinimo specifiškumo reikalavimai;

Daugkartinio PGR negalima atlikti Reikia projektuoti specifinius zondus, didelė kaina;

kartais zondo projektavimas yra sudėtingas

Susiję produktai: