PGR yra plačiausiai naudojama nukleorūgščių amplifikacijos technologija ir yra plačiai naudojama dėl savo jautrumo ir specifiškumo.Tačiau PGR reikalauja pakartotinio terminio denatūravimo ir negali atsikratyti apribojimų, susijusių su pasitikėjimu instrumentais ir įranga, o tai riboja jo taikymą klinikiniuose lauko bandymuose.

Nuo 1990-ųjų pradžios daugelis laboratorijų pradėjo kurti pastovios temperatūros stiprinimo technologiją, kuriai nereikia terminio denatūravimo.Dabar jie sukūrė kilpos tarpininkaujamą izoterminio amplifikacijos technologiją, grandinės pakeitimo izoterminio amplifikavimo technologiją, riedėjimo rato izoterminio amplifikacijos technologiją ir priklausomybę nuo nukleorūgščių sekos.Izoterminio stiprinimo technologija ir kitos technologijos. 

Loop tarpininkaujantis izoterminis stiprinimas

Amplifikacijos principas pagrįstas tuo, kad DNR yra dinaminės pusiausvyros būsenoje maždaug 65 °C temperatūroje.Kai bet kuris pradmuo yra suporuotas su bazėmis ir pratęsiamas iki papildomos dvigrandės DNR dalies, kita grandinė atsiskirs ir taps viengrande.

Esant tokiai temperatūrai, DNR naudoja 4 specifinius pradmenis, remdamasi grandinės poslinkio DNR polimeraze, kad grandinės poslinkio DNR sintezė nuolat cirkuliuotų savaime.

Pirmiausia nustatykite 6 specifinius tikslinio geno regionus F3, F2, F1, B1, B2, B3, tada suprojektuokite 4 pradmenis pagal šias 6 specifines sritis (kaip parodyta paveikslėlyje žemiau):

Priekinį vidinį pradmenį (FIP) sudaro F1c ir F2.

Atgalinis vidinis gruntas (BIP) sudarytas iš B1c ir B2, o TTTT naudojamas kaip tarpiklis viduryje.

Išoriniai pradmenys F3 ir B3 yra atitinkamai sudaryti iš tikslinio geno F3 ir B3 sričių.

LAMP reakcijos sistemoje vidinio grunto koncentracija yra kelis kartus didesnė nei išorinio grunto.Vidinis pradmuo pirmiausia sujungiamas su šablono grandine, kad būtų susintetinta papildoma grandinė ir susidaro dviguba DNR grandinė.Vėliau išorinis pradmuo sujungiamas su šablono grandine, kad susidarytų dviguba DNR grandinė.Veikiant BstDNR polimerazei, išsiskiria vidinio pradmens susintetinta komplementari grandinė.Po kelių reakcijų komplementarioji grandinė galiausiai sudaro vieną DNR grandinę su hantelio struktūra.

Pati hantelio struktūros DNR viena grandinė naudojama kaip šablonas nuolat formuojant pereinamosios kamieninės kilpos struktūros DNR su atviru galu.Vidiniai ir išoriniai pradmenys nukreipia pereinamosios kamieninės kilpos struktūros DNR, kad ji nuolat vyktų grandinės poslinkio ir pratęsimo reakcijas ir galiausiai sudarytų kelias skirtingo ilgio kamieninių kilpų struktūras.DNR mišinys.

Kilpinio izoterminio stiprinimo privalumai ir trūkumai

LAMP pranašumai:

(1) Didelis amplifikacijos efektyvumas, kuris gali efektyviai amplifikuoti 1–10 tikslinio geno kopijų per 1 valandą, o amplifikacijos efektyvumas yra 10–100 kartų didesnis nei įprasto PGR.

(2) Reakcijos laikas yra trumpas, specifiškumas yra stiprus ir nereikia specialios įrangos.

LAMP trūkumai:

(1) Gruntams keliami ypač aukšti reikalavimai.

(2) Amplifikuotas produktas negali būti naudojamas klonavimui ir sekos nustatymui, bet gali būti naudojamas tik vertinimui.

(3) Dėl didelio jautrumo iš jo lengvai susidaro aerozoliai, dėl kurių gaunami klaidingi teigiami rezultatai ir paveikiami bandymo rezultatai.

Strand poslinkio stiprinimas

Strand displacement amplifikacija (SDA) yra in vitro izoterminė DNR amplifikacijos technika, pagrįsta fermentine reakcija, kurią pirmą kartą pasiūlė amerikiečių mokslininkas Walkeris 1992 m.

Pagrindinė SDA sistema apima restrikcijos endonukleazę, DNR polimerazę su grandinės poslinkio aktyvumu, dvi poras pradmenų, dNTP, kalcio ir magnio jonus bei buferines sistemas.

Grandinės poslinkio amplifikacijos principas pagrįstas chemiškai modifikuota restrikcijos endonukleazės atpažinimo seka abiejuose tikslinės DNR galuose.Endonukleazė atveria tarpą DNR grandinės atpažinimo vietoje, o DNR polimerazė išplečia tarpą 3′ galo ir pakeičia kitą DNR grandinę.

Pakeistos atskiros DNR grandinės gali būti sujungtos su pradmenimis ir DNR polimerazės būdu išplėstos į dvigubas grandines.Šis procesas kartojamas nuolat, kad tikslinė seka būtų efektyviai sustiprinta.

Sruogų poslinkio stiprinimo technologijos privalumai ir trūkumai

SDA pranašumai:

Amplifikacijos efektyvumas yra didelis, reakcijos laikas trumpas, specifiškumas stiprus, nereikia specialios įrangos.

SDA trūkumai:

Produktai nėra vienodi, o kai kurie viengrandžiai ir dvigrandžiai gaminiai visada gaminami SDA cikle, o uodegos neišvengiamai atsiras aptikus elektroforezės būdu.

Rolingo apskritimo stiprinimas

Sukimo rato amplifikacija (RCA) siūloma remiantis DNR kopijavimo iš patogeninių organizmų metodu.Tai reiškia vienos grandinės žiedinės DNR naudojimą kaip šabloną esant pastoviai temperatūrai ir specialią DNR polimerazę (pvz., Phi29) ) Vykdant DNR sintezę riedėjimo ratu, kad būtų pasiektas tikslinio geno amplifikavimas.

RCA galima suskirstyti į tiesinį stiprinimą ir eksponentinį stiprinimą.Linijinio RCA efektyvumas gali siekti 10⁵kartų, o eksponentinės RCA efektyvumas gali siekti 10⁹laikai.

Paprastas skirtumas, kaip parodyta paveikslėlyje žemiau, tiesinė amplifikacija a naudoja tik 1 pradmenį, eksponentinė amplifikacija b turi 2 pradmenis.

Linijinis RCA taip pat vadinamas vieno pradmens RCA.Pradmenys jungiasi prie žiedinės DNR ir pratęsiami veikiant DNR polimerazei.Produktas yra linijinė viena grandinė su daugybe pasikartojančių sekų, tūkstančius kartų ilgesnė už vienos kilpos ilgį.

Kadangi linijinio RCA gaminys visada yra prijungtas prie pradinio pradmens, lengvas signalo fiksavimas yra didelis privalumas.

Eksponentinis RCA, taip pat žinomas kaip hiperšakotosios amplifikacijos HRCA (Hiper šakotasis RCA), esant eksponentiniam RCA, vienas pradmuo sustiprina RCA produktą, antrasis pradmuo hibridizuojasi su RCA produktu ir tęsiasi, o pakaitalas jau yra susietas su RCA produktu. Žemiau esantys pradmenys išplečia grandinę, o RCA pakartoja išplėtimą ir pakeitimą, kad būtų sukurtas dendrifikacinis produktas.

Riedėjimo rato nukleorūgščių amplifikacijos privalumai ir trūkumai

RCA pranašumai:

Didelis jautrumas, geras specifiškumas ir lengvas valdymas.

RCA trūkumai:

Fono problemos signalo aptikimo metu.RCA reakcijos metu necirkuliuotas spynos zondas ir nesurišto zondo šabloninė DNR arba RNR gali generuoti tam tikrus foninius signalus. 

Nukleicido seka pagrįsta amplifikacija

Nukleino rūgščių seka pagrįsta amplifikacija (NASBA) yra nauja technologija, sukurta PGR pagrindu.Tai nepertraukiama ir izoterminė nukleorūgščių amplifikacija, kuriai vadovauja pradmenų pora su T7 promotoriaus seka.Ši technologija gali amplifikuoti šabloninę RNR maždaug 109 kartus per maždaug 2 valandas, o tai yra 1000 kartų daugiau nei įprastinis PGR metodas ir nereikalauja specialios įrangos.

Ši technologija buvo naudojama greitam ligų diagnozavimui vos pasirodžius, o daugelis įmonių šiuo metu naudoja šį metodą RNR aptikimo rinkiniuose.

Nors RNR amplifikacija gali naudoti ir atvirkštinės transkripcijos PGR technologiją, NASBA turi savų privalumų: jį galima atlikti santykinai pastovios temperatūros sąlygomis, ji yra stabilesnė ir tikslesnė nei tradicinė PGR technologija.

Reakcija vyksta 41 laipsnio Celsijaus temperatūroje ir norint užbaigti reikia AMV (paukščių mieloblastozės viruso) atvirkštinės transkriptazės, RNazės H, T7 RNR polimerazės ir poros pradmenų.

Procesas daugiausia apima:

Priekinis pradmuo turi komplementarią T7 promotoriaus seką.Reakcijos metu priekinis pradmuo prisijungia prie RNR grandinės ir yra katalizuojamas AMV fermento, kad susidarytų DNR-RNR dviguba grandinė.

RNazė H virškina RNR hibridinėje dvigrandėje ir išlaiko vienos grandinės DNR.

Veikiant atvirkštiniam pradmeniui ir AMV fermentui, susidaro dviguba DNR grandinė, turinti T7 promotoriaus seką.

Veikiant T7 RNR polimerazei, transkripcijos procesas baigiamas ir susidaro didelis kiekis tikslinės RNR.

NASBA pranašumai:

(1) Jo pradmuo turi T7 promotoriaus seką, tačiau svetima dvigrandė DNR neturi T7 promotoriaus sekos ir negali būti amplifikuota, todėl ši technologija pasižymi dideliu specifiškumu ir jautrumu.

(2) NASBA tiesiogiai įtraukia atvirkštinės transkripcijos procesą į amplifikacijos reakciją, sutrumpindama reakcijos laiką.

NASBA trūkumai:

(1) Reakcijos komponentai yra sudėtingesni.

(2) Norint padidinti reakcijos kainą, reikia trijų rūšių fermentų.