RT-qPCR yra pagrindinis molekulinės biologijos eksperimentas, ir kiekvienas turi būti su juo susipažinęs.Jį daugiausia sudaro trys etapai: RNR ekstrahavimas, atvirkštinė transkripcija į cDNR ir realaus laiko fluorescencinė kiekybinė PGR.Tai nepadeda, kas vyksta?Tikėtina, kad yra problemų suatvirkštinės transkripcijos eksperimentas!Nors atrodo, kad atvirkštinės transkripcijos eksperimentui tereikia pridėti RNR, dNTP, pradmenis iratvirkštinė transkriptazėį centrifugos mėgintuvėlį ir gerai išmaišykite, tačiau realiame veikimo procese vis dar yra daug smulkmenų, į kurias reikia atkreipti dėmesį.Sužinokime apie tai!

Kaip įvertinti RNR kokybę?
Norint gauti cDNR, RNR kokybė yra labai svarbi!RNR kokybę galima nustatyti daugiausia iš dviejų aspektų:
(1) RNR vientisumas:RNR vientisumą galima patikrinti agarozės gelio elektroforeze. Kaip pavyzdį paėmus eukariotus, visa bendra RNR turi tris aiškias juostas, molekulinės masės nuo didelės iki mažos yra 28S, 18S ir 5S, o 28S yra dvigubai ryškesnės nei 18S;jei matomos trys juostos, bet juostos tipas yra neryškus arba difuzija reiškia, kad RNR iš dalies suskaidyta.Šiuo metu nedelsdami atlikite atvirkštinės transkripcijos reakciją ir atitinkamai padidinkite šablono įvestį;jei matoma tik mažos molekulinės masės juosta arba jos nėra, RNR buvo visiškai suardyta ir ją reikia iš naujo ekstrahuoti.Agilent 2100 rodo RNR vientisumą su smailių diagrama ir RIN reikšme.Jei nukleorūgštis nepažeista, elektroferogramos pradinė linija yra plokščia;jei nukleorūgštis smarkiai suskaidyta, pradinė linija yra netolygi ir atsiranda daugiau skilimo smailių;RIN reikšmė atspindi RNR vientisumą, diapazone nuo 0 iki 10, kuo didesnė reikšmė, tuo geresnė RNR kokybė.Na, kuo didesnis užbaigtumo laipsnis.
(2) RNR grynumas:OD260/280 santykį galima nustatyti UV spektrofotometrija.Jei OD260/280 santykis yra nuo 1,9 iki 2,1, grynumas yra labai geras.
Likusi genomo DNR gali lemti netikslius kiekybinius rezultatus
Kai RNR išgaunama, gauta RNR gali būti sumaišyta su genomine DNR (gDNR), kuri nebuvo išvalyta.Todėl cDNR po atvirkštinės transkripcijos taip pat bus sumaišyta sugDNR.Pasroviui metuqPCRreakcija,cDNRir gDNR gali būti amplifikuota vienu metu, todėl KT reikšmė yra santykinai maža, todėl rezultatai gali būti šališki.
Taigi, ką turėtume daryti šioje situacijoje?Foregenesiūlo:
(1) Atlikite atvirkštinės RNR genomo valymą, kuris gali būti pašalintas ekstrahuojant kolonėlę RNR ekstrahavimo metu;
(2) Išskirtą RNR apdorokite DNazeI , bet nutraukti jį EDTA;
atvirkštinės transkripcijos reagentųsu genomo valymo moduliais ;

Kaip pasirinkti pradmenis atvirkštinei transkripcijai?
Atvirkštinės transkripcijos pradmenys taip pat turi įtakos atvirkštinės transkripcijos reakcijos rezultatui.Atsižvelgdami į konkrečias eksperimento aplinkybes, atvirkštinei transkripcijai galite pasirinkti atsitiktinius pradmenis, Oligo dT arba genų specifinius pradmenis:
(1) Konkretūs nuorašai: rekomenduojami genų specifiniai pradmenys;
(2) Ilgi fragmentų nuorašai: rekomenduojami Oligo dT/genui specifiniai pradmenys;
(3) Vidiniai ilgo segmento nuorašų fragmentai: genų specifiniai pradmenys / atsitiktiniai pradmenys / atsitiktiniai pradmenys + Oligo dT.Jei bus atliktas tolesnis qPCR eksperimentas, Oligo dT negalima naudoti atskirai, nes naudojant vien Oligo dT gali atsirasti 3′ galo poslinkis, dėl kurio qPCR eksperimento rezultatai bus netikslūs;
(4) miRNR: Galima naudoti stiebo kilpos gruntus arba uodegos gruntus.

Kiek kartų reikia atskiesti atvirkštinės transkripcijos produkto cDNR kiekybiniam įvertinimui?
Gavus atvirkštinės transkripcijos produkto cDNR, labai svarbu, kiek kartų kDNR reikia praskiesti qPCR eksperimentams.Jei cDNR koncentracija yra per didelė arba per maža, gali būti paveiktas amplifikacijos efektyvumas.Ar galima išmatuoti cDNR koncentraciją ir kaip tai daryti?
(1) Atvirkštinės transkripcijos produkto cDNR koncentracijos išmatuoti negalima, nes, be cDNR produkto, atvirkštinės transkripcijos produkte taip pat yra atvirkštinės transkripcijos likučio buferio, atvirkštinės transkriptazės, pradmenų ir kt., kurie trukdys koncentracijos matavimo rezultatams ir sukels OD260/280, OD260/D derlius neatitinka normos 23.Šiuo metu kai kurie draugai sakys, tada išvalysiu koncentraciją;čia Foregene norėtųsi priminti, kad cDNR nerekomenduojama valyti, nes keičiant gautos cDNR ilgis skiriasi, o trumpoji cDNR gryninant bus prarasta.
(2) Taigi, ką daryti?Prieš atliekant qPCR eksperimentą, cDNR praskiedimo gradientas gali būti nustatytas atliekant išankstinį eksperimentą.Pavyzdžiui: naudokite cDNR pradinį tirpalą, 10 kartų praskiedimą ir 100 kartų praskiedimą kaip qPCR eksperimentų šablonus ir pasirinkite praskiedimo koeficientą, kurio CT vertė yra 18–28 diapazone.

Kaip miRNR turėtų būti atvirkštinis transkribavimas?
miRNR yra vienos grandinės mažos molekulės RNR, kurios dydis yra apie 22 nt, kuri nekoduoja baltymų.Dėl savo trumpo ilgio įprastiniu qPGR metodu sunku jį tiesiogiai kiekybiškai įvertinti, todėl dažnai reikia išplėsti miRNR;dažniausiai naudojami miRNR atvirkštinės transkripcijos metodai apima stiebo kilpos metodą ir uodegos metodą.
Kamieninės kilpos metodas yra išplėsti miRNR, pridedant kamieninės kilpos pradmenis.Šis aptikimo metodas pasižymi didesniu jautrumu ir specifiškumu, tačiau aptikimo našumas yra mažas.Viena atvirkštinė transkripcija gali aptikti tik vieną miRNR ir vidinę nuorodą;uodegos pridėjimo metodas susideda iš dviejų. Jį užbaigia bendras dviejų fermentų – PolyA polimerazės ir atvirkštinės transkriptazės – veikimas.PolyA polimerazė yra atsakinga už PolyA uodegų pridėjimą prie miRNR, kad padidintų jos ilgį, o atvirkštinė transkriptazė atlieka atvirkštinės transkripcijos reakciją.Šis metodas turi didelį aptikimo našumą ir gali aptikti kelias miRNR ir vidines nuorodas vienoje atvirkštinėje transkripcijoje, tačiau naudojant kamieninės kilpos metodą, jautrumas ir specifiškumas yra žemi.