PGR, daugkartinis PGR, In situ PGR, Atvirkštinis PGR, RT-PGR, qPCR (1)–PGR

Išsiaiškinsime įvairių PGR sąvokas, veiksmus ir detales

Ⅰ. PGR

Polimerazės grandininė reakcija, vadinama PGR, yra molekulinė biologinė technologija, naudojama specifiniams DNR fragmentams padidinti.Tai gali būti laikoma ypatinga DNR replikacija in vitro.DNR polimerazė (DNR polimerazė I) buvo atrasta dar 1955 m., o E. Coli Klenow fragmentą, kuris turi eksperimentinę vertę ir praktiškumą, daktaras H. Klenow atrado aštuntojo dešimtmečio pradžioje, tačiau kadangi šis fermentas netoleruoja temperatūros, aukšta temperatūra gali jį išsigimti, todėl neatitinka polimerazės grandininės reakcijos aukštoje temperatūroje.Šiandien naudojami fermentai (vadinami Taq polimeraze) buvo išskirti iš Thermus aquaticus, karštųjų versmių bakterijos 1976 m. Jo ypatybė yra ta, kad ji gali atlaikyti aukštą temperatūrą ir yra idealus fermentas, tačiau jis plačiai naudojamas po 1980 m.Pradinė pirminio primityvaus PGR prototipo koncepcija yra panaši į genų taisymą ir kopijavimą, kurį 1971 m. pasiūlė dr. KJell Kleppe. Jis paskelbė pirmąją paprastą ir trumpalaikę geno kopiją (panašią į pirmąsias dvi PGR reakcijas).Šiandien sukurtą PGR 1983 m. sukūrė dr. Kary B. Mullis. Dr. Mullis tais metais tarnavo PE įmonėms, todėl PE turi ypatingą statusą PGR pramonėje.Dr. Mullis oficialiai paskelbė pirmąjį susijusį straipsnį su Saiki ir kitais 1985 m. Nuo tada PGR naudojama tūkstančiai mylių per dieną, ir galima sakyti, kad dėl susijusių straipsnių kokybės daugelis kitų tyrimo metodų tampa neskanūs.Vėliau PGR technologija plačiai naudojama biologiniuose moksliniuose tyrimuose ir klinikiniuose pritaikymuose, tapdama svarbiausia molekulinės biologijos tyrimų technologija.Mullisas taip pat laimėjo 1993 m. Nobelio chemijos premiją.

PGRPrincipas

Pagrindinis PGR technologijos principas yra panašus į natūralų DNR replikacijos procesą, o jo specifiškumas priklauso nuo oligonukleotidinio pradmens, kuris yra komplementarus abiem tikslinės sekos galams.PGR susideda iš degeneracijos, susiliejimo ir pratęsimo trijų pagrindinių reakcijų etapų: ①Šablono DNR degeneracija: kai DNR šablonas tam tikrą laiką kaitinamas iki maždaug 93 °C, dvigubos DNR tirpalas, skirtas dvigubos grandinės DNR, susidaręs PGR amplifikuojant šablono DNR palikimą, sudaro vieną grandinę, kad būtų galima paruošti kitą pradinę reakciją.②Šablono DNR ir pradmenų sujungimas (junginys): kai DNR šablonas yra kaitinamas ir suskaidomas į vieną grandinę, temperatūra nukrenta iki maždaug 55 °C.Pradmenų ir šablono DNR vienos grandinės komplementari seka.③ Pradmenų pratęsimas: DNR šablonas – pradmenų surišimas pagrįstas TaqDNA polimerazės veikimu, o reakcijos žaliava yra dNTP.Laikykitės replikacijos principo, susintetinkite naują pusiau rezervuotą kopijų grandinę, papildančią šabloninę DNR grandinę, ir pakartokite degeneracijos-atkaitinimo-pratęsimo ciklą, tris procesus galite gauti daugiau „pusiau rezervuotos kopijos grandinės“, ir ši nauja grandinė vėl pasiekiama. Tapkite kito ciklo šablonu.Kilpai užbaigti reikia 2-4min, tikslinis genas gali būti amplifikuotas kelis milijonus kartų per 2-3 valandas.

StandartinisPGRReakcijos sistema

Penki PGR reakcijos elementai

PGR reakcijoje daugiausia dalyvauja penkių rūšių medžiagos, ty pradmenys, fermentas, dNTP, šablonas ir buferis (reikalingas Mg2+).[PGR procedūra]

Standartinis PGR procesas yra padalintas į tris etapus

1. DNR degeneracija (90°C-96°C): dviejų grandžių DNR šablonai veikiant terminiui, nutrūksta vandeniliniai ryšiai, susidaro vienos grandinės DNR.

2. Atkaitinimas (25℃ -65℃): sistemos temperatūra sumažinama, pradmenys sujungiami su DNR šablonu, kad susidarytų vietinė dviguba grandinė.

3. Prailginimas (70℃ -75℃): veikiant Taq fermentui (apie 72°C, geriausias aktyvumas), dNTP naudojamas kaip žaliava, tęsiasi nuo pradmenų 5′ galo → 3′ galo, sintezė ir šablonas papildo viena kitą DNR grandinę.

Kiekvienas ciklas denatūruojamas, atkaitinamas ir pratęsiamas, padvigubinant DNR kiekį.Šiuo metu dėl trumpos amplifikacijos srities kai kuriuos PGR galima atkartoti per labai trumpą laiką, net jei Taq fermento aktyvumas nėra optimalus, todėl jį galima pakeisti į du etapus, tai yra, atkaitinimą ir pratęsimą galima atlikti 60°C-65°C temperatūroje tuo pačiu metu.Siekiant sumažinti kėlimo ir aušinimo procesą bei pagerinti atsako greitį.

PGR reakcijos savybės

● Didelis specifiškumas

Konkretūs lemiami PGR atsako veiksniai yra: ① Specifinis pradmenų ir šablono DNR derinys.②Pagrindų poravimo principas.③ TaqDNA polimerazės sintezės reakcijos ištikimybė.④ Tikslinio geno specifiškumas ir konservatyvumas.

Svarbiausia yra tinkamas gruntų ir šablonų derinys.Grunto ir šablono surišimas bei pradmenų grandinės pratęsimas grindžiamas šarminės bazės suderinimo principu.Polimerazės sintezės reakcijų ištikimybė ir Taq DNR polimerazės atsparumas aukštai temperatūrai, kad būtų galima susieti (junginį) šabloną ir pradmenį reakcijoje, galima atlikti aukštesnėje temperatūroje.Labai padidėja derinio specifiškumas.Klipas gali išlaikyti aukštą teisingumo laipsnį.Pasirinkus tikslinį genetinį regioną, pasižymintį dideliu konservatyvumu ir dideliu konservatyvumu, jo specifiškumas yra didesnis.

● Didelis jautrumas

PGR produktų gamybos apimtis padidinama indeksu, kuris gali išplėsti Picker pradinį šabloną (PG=10-12) ir padidinti mikrovaldiklio lygį iki mikrogramų lygio (μg= -6).Tikslines ląsteles galima aptikti iš 1 milijono ląstelių;aptinkant virusus, PGR jautrumas gali siekti 3 RFU (tuščios dėmės sudaro vienetus);minimalus aptikimo dažnis bakterijų moksle yra 3 bakterijos.

● Paprasta ir greita

PGR atspindys naudoja aukštos temperatūros Taq DNR polimerazę, kuri vienu metu prideda reakcijos tirpalo, tai yra degeneracijos-atkaitinimo-pratęsimo reakcija ant DNR amplifikacijos tirpalo ir vandens vonios indo.Paprastai amplifikacijos reakcija baigiama per 2–4 valandas.Papildyti produktai paprastai analizuojami naudojant elektrinį kardą, todėl jiems nereikia naudoti izotopų, radioaktyviosios taršos ir lengvo reklamavimo.

● Mėginio grynumas žemas

Nereikia atskirti virusų ar bakterijų ir kultūrinių ląstelių.Neapdoroti DNR produktai ir RNR gali būti naudojami kaip stiprintuvai.DNR amplifikacijos aptikimas gali būti naudojamas tiesiogiai naudojant klinikinius mėginius, tokius kaip kraujas, kūno skystis, kosulio plovimo skystis, plaukai, ląstelės ir gyvi audiniai.

PGRbendrų problemų

● Klaidingai neigiamas, nėra sustiprintų juostų

Pagrindiniai PGR reakcijos etapai apima: ① šabloninių nukleorūgščių paruošimą, ② pradmenų kokybę ir specifiškumą, ③ fermentų kokybę ④ PGR ciklo sąlygas.Taip pat reikėtų išanalizuoti ir išnagrinėti pirmiau pateiktas nuorodas, kaip rasti priežastį.

Šablonai: ① Šablone yra įvairių baltymų, ② šablone yra Taq fermento inhibitorių, ③ šablone esantis baltymas nepašalinamas, ypač grupės baltymas chromosomoje.⑤ Išminuotojų nukleorūgščių degeneracija nėra kruopšti.Kai fermentų ir pradmenų kokybė gera, nėra amplifikacijos juostos, o tai greičiausiai yra mėginių virškinimo traktas.Šablono nukleorūgščių ekstrahavimo procese kažkas negerai, todėl norint paruošti veiksmingą ir stabilų virškinimo tirpalą, jo procedūra turi būti fiksuota, o ne savavališkai keisti.

Fermento inaktyvavimas: norint išanalizuoti, ar fermento aktyvumas yra prarastas, ar nepakankamas, todėl gaunami klaidingi neigiami rezultatai, kartu reikia naudoti naują fermentą arba senus ir naujus fermentus.Reikėtų pažymėti, kad Taq fermentas arba etidžio bromidas kartais pamirštamas.

Gruntas: grunto kokybė, grunto koncentracija ir ar dviejų gruntų koncentracija yra simetriška.Tai yra dažna PGR gedimo priežastis arba didėjanti juosta nėra ideali ir linkusi išsklaidyti.Kyla problemų dėl kai kurių partijų numerių pradmenų kokybės.Du pradmenys turi didelę ir mažą koncentraciją, todėl mažo efektyvumo asimetrinė amplifikacija.Atsakomosios priemonės yra šios: ① Pasirinkite gerą pradmenį vienetams sintetinti.② Grunto koncentracija priklauso ne tik nuo OD vertės, bet ir atkreipia dėmesį į pradinį grunto skystį, kad būtų galima atlikti agaro cukraus gelio elektroforezę.Turi būti grunto juostelės zona, o dviejų gruntų ryškumas iš esmės turi būti vienodas.Šiuo metu diržas, PGR gali sugesti ir tai turėtų būti išspręsta naudojant pradmenų sintezės įrenginį.Jei gruntas yra didelis, ryškumas yra mažas, o praskiedus jo koncentracija turi būti subalansuota.③ Už gruntą reikia mokėti ir laikyti didelėje koncentracijoje, kad šaldytuvo dalys nesušaltų arba ilgai neužšaltų, nes dėl to gruntas susidės ir suyra.④ Grunto konstrukcija yra neprotinga, pavyzdžiui, grunto ilgis yra nepakankamas, o tarp gruntų susidaro diklasteris.

Mg2+koncentracija: Mg2+jonų koncentracija turi didelę įtaką PGR amplifikacijos efektyvumui.Per didelė koncentracija gali sumažinti priešingos lyties PGR amplifikaciją.Jei koncentracija yra per maža, PGR amplifikacijos išvestis netgi sukels PGR amplifikacijos nesėkmę be išplėtimo juostos.

Reakcijos tūrio pokytis: PGR amplifikacijai naudojamas tūris yra 20 ul, 30 ul ir 50 ul arba 100 uL, didelis PGR amplifikacijos taikymo tūris nustatomas pagal skirtingus mokslinių tyrimų ir klinikinių tyrimų tikslus.Padarius mažus tūrius, tokius kaip 20ul, gaminant dydį būtina padaryti laido būklę, kitaip jis suges.

Fizinės priežastys: transformacija yra labai svarbi PGR amplifikacijai.Jei degeneracijos temperatūra žema, degeneracijos laikas trumpas, tikėtina, kad tai įvyks esant klaidingai neigiamai;per žema atkaitinimo temperatūra gali sukelti nespecifinį stiprinimą ir sumažinti specifinį stiprinimo efektyvumą.Labai paveikia pradmenų ir šablonų derinį, kad sumažintų PGR amplifikacijos efektyvumą.Kartais reikia naudoti standartinius termometrus, kad būtų galima nustatyti kintamumą, atkaitinimą ir pailgėjusią temperatūrą prailginamojoje arba vandenyje tirpioje viryklėje, o tai yra viena iš PGR gedimo priežasčių.

Tikslinės sekos variantai: jei įvyksta tikslinė seka, mutacija ar delecija, prototipo ir šablono derinys sujungiamas arba dėl tikslinės sekos trūkumo pradmuo ir šablonas praras komplementarią seką, o jos PGR amplifikacija nebus sėkminga.

● Klaidingai teigiamas

Atrodo, kad PGR amplifikacijos juosta atitinka tikslinės sekos juostą, o kartais jos juosta yra tvarkingesnė ir aukštesnė.

Pradmenų dizainas netinkamas: pasirinkta amplifikacijos seka ir netikslinė amplifikacijos seka yra homologinės, todėl atliekant PGR amplifikaciją, amplifikuoti PGR produktai yra netikslingos sekos.Tikslinė seka per trumpa arba pradmuo per trumpas, todėl ji gali būti klaidingai teigiama.Reikia pertvarkyti.

Kryžminė tikslinės sekos arba amplifikacijos produktų tarša: yra dvi šios taršos priežastys: Pirma, kryžminė viso genomo arba didelių segmentų tarša, dėl kurios gaunami klaidingi teigiami rezultatai.Tokį klaidingą teigiamą rezultatą galima pašalinti šiais metodais: Naudodami būkite atsargūs ir švelnūs, kad tikslinė seka nepatektų į mėginio pistoletą arba neištaškytų iš išcentrinio vamzdelio.Išskyrus fermentus ir medžiagas, kurios negali atlaikyti aukštos temperatūros, visi reagentai ar įranga turi būti dezinfekuojami aukštu slėgiu.Išcentriniai vamzdžiai ir mėginiai turi būti naudojami vienu metu.Jei reikia, prieš pridedant mėginius, reakcijos vamzdelis ir reagentas veikiami ultravioletiniais spinduliais, kad būtų sunaikinta esama nukleorūgštis.Antra, nedideli oro taršos fragmentai.Šie maži fragmentai yra trumpesni nei tikslinė seka, tačiau jie turi tam tikrą homologiją.Jis gali būti sujungtas vienas su kitu.Pridėjus pradmenis, PGR produktas gali būti išplėstas, o tai sukels klaidingai teigiamą gamybą.Jis gali būti naudojamas norint sumažinti arba panaikinti lizdo PGR metodą.

● Pasirodo nespecifinė stiprinimo juosta

Juostos, kurios atsirado po PGR amplifikacijos, yra nesuderinamos su numatomu dydžiu, didelės ar mažos, arba tuo pačiu metu, arba tuo pačiu metu, specifinės amplifikacijos juostos ir nespecifinės amplifikacijos juostos.Nespecifinių juostų atsiradimas yra toks: Pirma, pradmenys nevisiškai papildo tikslinę seką arba pradmenų polimerizacija sudaro di klasterį.Antra, MG2+ jonų koncentracija yra per didelė, atkaitinimo temperatūra per žema, o PGR ciklų skaičius yra susijęs.Antra, fermentų kokybė ir kiekis.Dažnai kai kurių šaltinių fermentai yra linkę į neypatingas juostas, o kito šaltinio fermentai nepasitaiko.Kartais pasireiškia ir nespecifinis fermentų amplifikacija.Atsakomosios priemonės yra šios: prireikus perkurti patrauklius daiktus.Sumažinkite fermento kiekį arba pakeiskite kito šaltinio fermentą.Sumažinkite pirminių skaičių, atitinkamai padidinkite šablonų skaičių ir sumažinkite ciklų skaičių.Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą arba naudokite dviejų temperatūrų metodą (93°C degeneracija, atkaitinimas ir pratęsimas maždaug 65°C).

● Atrodo sluoksniuotos kuodelės arba tepimo juosta

Kartais atrodo, kad PGR amplifikacija taikoma arba padengta apvalkalu arba kaip kiliminė juosta.Dėl šios priežasties dėl per didelio fermentų kiekio ar prastos fermento kokybės per didelė dNTP koncentracija, per didelė Mg2+ koncentracija, per žema atkaitinimo temperatūra, per didelis ciklų skaičius.Atsakomosios priemonės yra šios: ①Sumažinkite fermentų kiekį arba pakeiskite kito šaltinio fermentą.② Sumažinkite dNTP koncentraciją ③ Tinkamai sumažinkite Mg2+ koncentraciją.④Padidinkite šablonų skaičių ir sumažinkite ciklų skaičių.

Susiję produktai

PCR Heroᵀᴹ (su dažais)

◮ Didesnis tikslumas: 6 kartus didesnis už įprastą Taq fermentą;

◮ Didesnis stiprinimo greitis

◮ Didesnis šablono pritaikymas

◮ Didesnis stiprinimo efektyvumas

◮ Aplinkos tolerancija yra stipresnė: savaitę laikoma 37°C temperatūroje, išlaikant daugiau nei 90% aktyvumo;

◮ Pasižymi 5'→3' DNR polimerazės aktyvumu ir 5'→3' egzonukleazės aktyvumu, be 3'→5' egzonukleazės aktyvumo.

PCR Easyᵀᴹ (su dažais)

Dėl unikalios reakcijos sistemos ir didelio efektyvumo Taq DNR polimerazės PGR reakcija pasižymi didesniu amplifikacijos efektyvumu, specifiškumu ir jautrumu.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (vienas žingsnis)-SYBR Green I

◮ Vieno žingsnio rinkinys leidžia atvirkštinei transkripcijai ir qPCR atlikti dvi reakcijas tame pačiame mėgintuvėlyje, tereikia pridėti šabloninę RNR, specifinius PGR pradmenis ir be RNazės ddH.₂O.

◮ Rinkinys gali greitai ir efektyviai kiekybiškai išanalizuoti viruso RNR arba atsekti RNR.

◮ Rinkinyje naudojamas unikalus Foregene atvirkštinės transkripcijos reagentas ir Foregene HotStar Taq DNR polimerazė kartu su unikalia reakcijos sistema, siekiant efektyviai pagerinti amplifikacijos efektyvumą ir reakcijos specifiškumą.

◮ Optimizuota reakcijos sistema padidina reakcijos aptikimo jautrumą, stipresnį terminį stabilumą ir geresnę toleranciją.

◮ RT-qPCR Easy^TM(One Step)-SYBR Green I rinkinyje yra ROX vidinis etaloninis dažiklis, kuris gali būti naudojamas pašalinti signalo foną ir signalo klaidas tarp šulinių, o tai klientams patogu naudoti įvairiuose kiekybinių PGR prietaisų modeliuose.

RT Easy^TMII (Pagrindinis premiksas, skirtas pirmosios grandinės cDNR sintezėRealaus laiko PGR)

- Veiksmingas gebėjimas pašalinti gDNR, kuri gali pašalinti gDNR iš šablono per 2 minutes.

- Veiksminga atvirkštinės transkripcijos sistema, pirmosios krypties cDNR sintezė užtrunka tik 15 minučių.

-Sudėtingi šablonai: šablonus su dideliu GC turiniu ir sudėtinga antrine struktūra taip pat galima pakeisti labai efektyviai.

- Didelio jautrumo atvirkštinės transkripcijos sistema, pg lygio šablonai taip pat gali gauti aukštos kokybės cDNR.

- Atvirkštinės transkripcijos sistema turi aukštą šiluminį stabilumą, optimali reakcijos temperatūra yra 42 ℃, ir ji vis dar turi gerą atvirkštinės transkripcijos našumą esant 50 ℃.