PGR (polimerazės grandininė reakcija) yra viena iš in vitro DNR amplifikacijos technologijų, turinti daugiau nei 30 metų istoriją.

1983 m. PGR technologijos pradininkas buvo Kary Mullis iš Cetus, JAV. 1985 m. Mullis pateikė PGR patento paraišką ir tais pačiais metais paskelbė pirmąjį PGR akademinį darbą apie mokslą.1993 m. Mullis už savo darbą buvo apdovanotas Nobelio chemijos premija.

Pagrindiniai PGR principai

PGR gali amplifikuoti tikslinius DNR fragmentus daugiau nei vieną milijoną kartų.Principas yra katalizuojamas DNR polimerazės, naudojant pradinę DNR grandinę kaip šabloną ir specifinį pradmenį kaip pradinį pratęsimo tašką.Jis atkartojamas in vitro atliekant tokius veiksmus kaip denatūravimas, atkaitinimas ir pratęsimas.Dukterinės grandinės DNR, kuri papildo pagrindinės grandinės šablono DNR, procesas.

Standartinis PGR procesas yra padalintas į tris etapus:

1. Denatūravimas: DNR dviguboms grandinėms atskirti naudokite aukštą temperatūrą.Vandenilio ryšys tarp DNR dvigubų grandžių nutrūksta aukštoje temperatūroje (93-98 ℃).

2. Atkaitinimas: Atskyrus dvigrandę DNR, sumažinkite temperatūrą, kad pradmenys galėtų prisijungti prie vienos grandinės DNR.

3. Išplėtimas: DNR polimerazė pradeda sintetinti papildomas grandines išilgai DNR grandžių iš pradmenų, surištų, kai temperatūra nuleidžiama.Kai pratęsimas baigiamas, ciklas baigiamas ir DNR fragmentų skaičius padvigubėja

Šiuos tris etapus 25-35 kartus pakartojus, DNR fragmentų skaičius padidės eksponentiškai.

PGR išradingumas yra tas, kad skirtingi pradmenys gali būti sukurti skirtingiems tiksliniams genams, todėl tikslinių geno fragmentai gali būti amplifikuoti per trumpą laiką.

Kol kas PGR galima suskirstyti į tris kategorijas, būtent įprastą PGR, fluorescencinę kiekybinę PGR ir skaitmeninę PGR.

Pirmoji įprasto PGR karta

Norėdami amplifikuoti tikslinį geną, naudokite įprastą PGR amplifikacijos instrumentą, o tada naudokite agarozės gelio elektroforezę produktui aptikti. Galima atlikti tik kokybinę analizę.

Pagrindiniai pirmosios kartos PGR trūkumai:

1.Polinkis į nespecifinį amplifikaciją ir klaidingai teigiamus rezultatus.

2. Aptikimas užtrunka ilgai, o operacija yra sudėtinga.

3. Galima atlikti tik kokybinį testą

Antros kartos realaus laiko PGR

Realiojo laiko PGR, taip pat žinomas kaip qPCR, naudoja fluorescencinius zondus, kurie gali rodyti reakcijos sistemos eigą, ir stebi sustiprintų produktų kaupimąsi kaupiant fluorescencinius signalus, o rezultatus vertina pagal fluorescencijos kreivę.Jį galima kiekybiškai įvertinti naudojant Cq vertę ir standartinę kreivę.

Kadangi qPCR technologija vykdoma uždaroje sistemoje, sumažėja užteršimo tikimybė, o fluorescencinis signalas gali būti stebimas kiekybiniam aptikimui, todėl ji yra plačiausiai naudojama klinikinėje praktikoje ir tapo dominuojančia PGR technologija.

Fluorescencinės medžiagos, naudojamos realaus laiko fluorescencinėje kiekybinėje PGR, gali būti suskirstytos į: TaqMan fluorescencinį zondą, molekulinius švyturius ir fluorescencinius dažus.

1) TaqMan fluorescencinis zondas:

PGR amplifikacijos metu pridedamas specifinis fluorescencinis zondas, pridedant pradmenų porą.Zondas yra oligonukleotidas, o abu galai yra pažymėti reporterio fluorescencine grupe ir gesinimo fluorescencine grupe.

Kai zondas nepažeistas, reporterių grupės skleidžiamą fluorescencinį signalą sugeria gesinimo grupė;PGR amplifikacijos metu Taq fermento 5′-3′ egzonukleazės aktyvumas suskaido ir suardo zondą, todėl reporterio fluorescencinė grupė ir gesintuvas. Fluorescencinė grupė yra atskirta, kad fluorescencijos stebėjimo sistema galėtų priimti fluorescencijos signalą, t. yra visiškai sinchronizuotas su PGR produkto susidarymu.

2) SYBR fluorescenciniai dažai:

PGR reakcijos sistemoje pridedamas SYBR fluorescencinio dažiklio perteklius.Po to, kai SYBR fluorescenciniai dažai yra nespecifiškai įtraukiami į DNR dvigubą grandinę, jis skleidžia fluorescencinį signalą.SYBR dažų molekulė, kuri nėra įtraukta į grandinę, neskleis jokio fluorescencinio signalo, taip užtikrinant fluorescencinį signalą. PGR produktų padidėjimas yra visiškai sinchronizuojamas su PGR produktų padidėjimu.SYBR jungiasi tik su dvigrandės DNR, todėl pagal lydymosi kreivę galima nustatyti, ar PGR reakcija yra specifinė.

3) Molekulinis švyturys:

Tai yra stiebo kilpa, dvigubai pažymėtas oligonukleotidinis zondas, kuris sudaro maždaug 8 bazių plaukų segtuko struktūrą 5 ir 3 galuose.Nukleino rūgščių sekos abiejuose galuose yra komplementariai suporuotos, todėl fluorescencinė grupė ir gesinimo grupė yra sandarios.Uždarykite, fluorescencija nebus sukurta.

Sukūrus PGR produktą, atkaitinimo proceso metu vidurinė molekulinio švyturio dalis suporuojama su specifine DNR seka, o fluorescencinis genas atskiriamas nuo gesinimo geno, kad susidarytų fluorescencija.

Pagrindiniai antrosios kartos PGR trūkumai:

Jautrumo vis dar trūksta, o mažos kopijos mėginiai aptinkami netiksliai.

Yra foninės reikšmės įtaka, o rezultatas gali trukdyti.

Kai reakcijos sistemoje yra PGR inhibitorių, aptikimo rezultatai gali trukdyti.

Trečiosios kartos skaitmeninis PGR

Skaitmeninis PGR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) apskaičiuoja tikslinės sekos kopijų skaičių, aptikdamas galutinį tašką, ir gali atlikti tikslų absoliučią kiekybinį aptikimą nenaudodamas vidinių kontrolės priemonių ir standartinių kreivių.

Skaitmeninis PGR naudoja galutinio taško aptikimą ir nepriklauso nuo Ct vertės (ciklo slenksčio), todėl skaitmeninę PGR reakciją mažiau veikia amplifikacijos efektyvumas, o tolerancija PGR reakcijos inhibitoriams yra geresnė, o tikslumas ir atkuriamumas yra didelis.

Dėl didelio jautrumo ir didelio tikslumo savybių PGR reakcijos inhibitoriai lengvai netrukdo ir gali pasiekti tikrą absoliutų kiekį be standartinių produktų, kurie tapo tyrimų ir taikymo tašku.

Pagal skirtingas reakcijos vieneto formas jį galima suskirstyti į tris pagrindinius tipus: mikroskysčių, lustų ir lašelių sistemas.

1) Mikrofluidinis skaitmeninis PGR, mdPCR:

Remiantis mikrofluidine technologija, DNR šablonas yra atskirtas.Mikrofluidinė technologija gali realizuoti mėginio nano patobulinimą arba mažesnių lašelių generavimą, tačiau lašeliams reikia specialaus adsorbcijos metodo, o tada sujungti su PGR reakcijos sistema.mdPCR palaipsniui buvo priimtas kitais metodais.

2) Skaitmeninis PGR lašelių pagrindu, ddPCR:

Naudokite vandens aliejuje lašelių generavimo technologiją, kad mėginys būtų apdorotas lašeliais, o reakcijos sistemą, kurioje yra nukleino rūgšties molekulių, padalinkite į tūkstančius nanoskalės lašelių, kurių kiekviename nėra aptiktinos nukleorūgšties tikslinės molekulės arba yra nuo vienos iki kelių tikslinių nukleino rūgšties molekulių, kurias reikia tirti.

3) Lustinė skaitmeninė PGR, cdPCR:

Naudokite integruotą skysčio kelio technologiją, norėdami išgraviruoti daug mikrovamzdelių ir mikroertmių ant silicio plokštelių ar kvarcinio stiklo, valdyti tirpalo srautą per skirtingus valdymo vožtuvus ir padalyti mėginio skystį į tokio paties dydžio nanometrus į reakcijos šulinius skaitmeninei PGR reakcijai, kad būtų pasiektas absoliutus kiekybinis įvertinimas.

Pagrindiniai trečiosios kartos PGR trūkumai:

Įranga ir reagentai yra brangūs.

Šablonų kokybės reikalavimai yra aukšti.Jei šablono kiekis viršija mikrosistemos kiekį, bus neįmanoma kiekybiškai įvertinti, o jei jis per mažas, kiekybinio nustatymo tikslumas sumažės.

Klaidingi teigiami rezultatai taip pat gali būti generuojami, kai yra nespecifinis stiprinimas.