COVID-19 yra infekcinė liga, kurią sukelia sunkus ūminis kvėpavimo sindromas, 2 tipo koronavirusas. Kai žmogus užsikrečia, dažniausiai pasireiškia karščiavimas, kosulys ir dusulys.

Tyrimui naudojami mėginiai gali būti paimti nosiaryklės arba burnos ir ryklės tepinėliais.

Kas yra PGR?

Standartinis koronaviruso aptikimo metodas yra polimerazės grandininė reakcija, PGR.Tai metodas, plačiai naudojamas molekulinėje biologijoje.Jis gali greitai nukopijuoti nuo milijonų iki milijardų specifinių DNR fragmentų.

Naujajame koronaviruse yra labai ilgas vienos grandinės RNR genomas.Norint aptikti šiuos virusus PGR, RNR molekulės turi būti konvertuojamos į jų komplementarias DNR sekas atvirkštinės transkriptazės būdu, o tada naujai susintetinta DNR gali būti amplifikuojama taikant standartines PGR procedūras, kurios paprastai žinomos kaip RT-PGR.

RT-PGR procesas

RNR ekstrahavimas

Norint atlikti šį metodą, iš esmės reikia ekstrahuoti viruso RNR.Patogiam, greitam ir efektyviam atskyrimui galima naudoti įvairius RNR valymo rinkinius.

Norėdami išgauti virusinę RNR naudodami komercinį rinkinį, pirmiausia įdėkite mėginį į mikrocentrifugos mėgintuvėlį ir sumaišykite jį su lizės buferiu.Šis buferis yra labai denatūruotas ir paprastai susideda iš fenolio ir guanidino izotiocianato.Be to, lizės buferyje paprastai yra RNazės inhibitorių, kad būtų užtikrinta nepažeistos virusinės RNR išskyrimas.

Įdėję lizės buferio, maišymo mėgintuvėlį sumaišykite pulsu ir inkubuokite kambario temperatūroje.Tada virusas lizuojamas labai denatūruojančiomis sąlygomis, kurias užtikrina lizės buferis.

Po to, kai mėginys lizuojamas, valymo procedūrai naudojamas centrifuginis mėgintuvėlis.Mėginys įdedamas į centrifugos mėgintuvėlį ir tada centrifuguojamas.

Ši procedūra yra kietosios fazės ekstrahavimo metodas, kai stacionarioji fazė susideda iš silikagelio matricos.

Esant optimalioms druskos ir pH sąlygoms, RNR molekulės jungiasi prie silicio dioksido membranos.

Tuo pačiu metu pašalinami baltymai ir kiti teršalai.

Po centrifugavimo įdėkite centrifugos mėgintuvėlį į švarų surinkimo mėgintuvėlį, išmeskite filtratą ir įpilkite plovimo buferio.

Vėl įdėkite mėgintuvėlį į centrifugą, kad plovimo buferis prasiskverbtų per membraną.Taip iš membranos bus pašalintos visos likusios priemaišos, o prie silikagelio liks tik RNR.

Išplovus mėginį, mėgintuvėlį įdėkite į švarų mikrocentrifugos mėgintuvėlį ir įpilkite eliuavimo buferio.

Tada jis centrifuguojamas, kad eliuavimo buferis prasiskverbtų per membraną.Eliuavimo buferis pašalina virusinę RNR iš sukimo kolonėlės ir gauna išgrynintą RNR, kurioje nėra baltymų, inhibitorių ir kitų teršalų.

2 ŽINGSNIS

Mišrus koncentratas

Išskyrus viruso RNR, kitas žingsnis yra reakcijos mišinio paruošimas PGR amplifikacijai.Šiame etape naudojamas koncentratas.Šis koncentruotas tirpalas yra iš anksto sumaišytas koncentruotas tirpalas, sudarytas iš premikso, atvirkštinės transkriptazės, nukleotidų, priekinio pradmens, atvirkštinio pradmens, TaqMan zondo ir DNR polimerazės.

Galiausiai, norint užbaigti šį reakcijos mišinį, pridedamas RNR šablonas.Mėgintuvėliai sumaišomi impulsiniu sūkuriu, o tada reakcijos mišinys įpilamas į PGR plokštelę.PGR plokštelėje paprastai yra 96 ​​šulinėliai ir vienu metu galima analizuoti kelis mėginius.

3 ŽINGSNIS

PCR amplifikacija

Tada įdėkite plokštelę į PGR įrenginį, kuris iš esmės yra terminis cikleris.

Realaus laiko RT-PGR naudojamas aptikti 2019 m. naują koronavirusą, amplifikuojant tikslinę seką RdrRP geno, E ir N geno.Tikslinio geno pasirinkimas priklauso nuo pradmenų ir zondo sekos.

Pirmasis RT-PGR žingsnis yra atvirkštinė transkripcija.Sintetinama pirmoji komplementariosios DNR grandinė, kurią inicijuoja PGR atvirkštinis pradmuo, kuris jungiasi prie komplementarios viruso RNR genomo dalies.Tada atvirkštinė transkriptazė prideda DNR nukleotidus prie pradmens 3′ galo, kad susintetintų DNR, komplementarią su viruso RNR.Šio etapo temperatūra ir trukmė priklauso nuo pradmenų, tikslinės RNR ir atvirkštinės transkriptazės.

Tada taikomas pradinis denatūravimo etapas, dėl kurio denatūruojamas RNR-DNR hibridas.Šis žingsnis yra būtinas norint suaktyvinti DNR polimerazę.Tuo pačiu metu atvirkštinė transkriptazė yra inaktyvuota.

PGR susideda iš kelių terminių ciklų.Kiekvienas ciklas susideda iš denatūravimo, atkaitinimo ir pratęsimo etapų.

Denatūravimo etapas apima reakcijos kameros kaitinimą iki 95 laipsnių Celsijaus ir panaudojimą dvigrandės DNR šablono denatūravimui.

Kitame etape reakcijos temperatūra sumažinama iki 58 laipsnių Celsijaus, leidžiant priekiniam pradmeniui prisijungti prie papildomos jo vienos grandinės DNR šablono dalies.Atkaitinimo temperatūra tiesiogiai priklauso nuo grunto ilgio ir sudėties.

Prailginimo etape DNR polimerazė sintezuoja naują DNR grandinę, kuri yra komplementari DNR šablono grandinei.Pridedant laisvus branduolius, papildančius šabloną 5′–3′ kryptimi nuo reakcijos mišinio.Šio etapo temperatūra priklauso nuo naudojamos DNR polimerazės.

Po pirmojo ciklo gaunamas dvigrandės DNR taikinys.

Tada įveskite antrą ciklą.Dvigrandė DNR denatūruojama ir susidaro dvi viengrandės DNR molekulės.

Kitame etape reakcijos temperatūra sumažinama, pradmenys sujungiami su kiekvienu vienos grandinės DNR šablonu, o Taq-man zondas prijungiamas prie papildomos tikslinės DNR dalies.

TaqMan zondą sudaro fluoroforas, kovalentiškai prijungtas prie oligonukleotidinio zondo 5′ galo.Kai jį sužadina ciklerio šviesos šaltinis, fluoroforas skleidžia fluorescenciją.Be to, zondą sudaro gesintuvas 3′ gale.Reporterio geno artumas prie gesintuvo neleidžia aptikti fluorescencijos.

Prailginimo etape DNR polimerazė sintezuoja naują grandinę.Kai polimerazė pasiekia TaqMan zondą, jos endogeninis 5′nukleazės aktyvumas suskaido zondą, atskirdamas dažus nuo gesintuvo.

Su kiekvienu PGR ciklu išsiskiria daugiau dažų molekulių, todėl fluorescencijos intensyvumas didėja proporcingai susintetintų amplikonų skaičiui.

Šis metodas leidžia įvertinti tam tikros sekos, esančios imtyje, skaičių.Dvigrandžių DNR fragmentų skaičius padvigubėja kiekviename cikle.Todėl PGR gali būti naudojamas labai mažiems mėginiams analizuoti.

Liuminescenciniam signalui matuoti, volframo halogeninei lempai, sužadinimo filtrui, reflektoriui, objektyvui, emisijos filtrui ir įkrovimui sujungtam įrenginiui naudokite CCD kamerą.

4 ŽINGSNIS Aptikti

Liuminescenciniam signalui matuoti, volframo halogeninei lempai, sužadinimo filtrui, reflektoriui, objektyvui, emisijos filtrui ir įkrovimui sujungtam įrenginiui naudokite CCD kamerą.

Filtruota lempos šviesa atsispindi reflektoriumi, praeina per kondensatoriaus lęšį ir sufokusuojama į kiekvienos skylės centrą.Tada iš skylės skleidžiama fluorescencija atsispindi veidrodyje, praeina pro emisijos filtrą ir ją aptinka CCD kamera.Kiekviename PGR cikle CCD gali aptikti savaime sužadintą fluoroforo šviesą.

Jis paverčia užfiksuotą šviesą į skaitmeninius duomenis.Šis metodas vadinamas realaus laiko PGR ir leidžia realiuoju laiku stebėti PGR reakcijos eigą.