Visi kalba apie qRT-PGR eksperimento principą, pradmenų dizainą, rezultatų interpretavimą ir pan., bet manau, kad turėčiau pasidalinti su jumis eksperimentiniu qRT-PGR veikimu.Tai maža, bet tai susiję su rezultatais.
Prieš atlikdami qRT-PGR, turime aiškiai suprasti savo RNR ir veikimo metodus.Juk mūsų pastangos yra skirtos rezultatams, o ne tiesiog praktikai.Taigi, prieš atlikdami qRT-PGR, turime nustatyti šias problemas (kai kurios iš jų taikomos tik SYBR).
1 Ar esate tikri, kad jūsų RNR nesuardyta?
NanoDrop 2000 gali aptikti tik RNR koncentraciją ir grynumą, bet negali aptikti RNR vientisumo.
RNR (RNA Intesity Number) reikšmė gali atspindėti RNR vientisumą, kurį aptinka Agilent 2100 Bioanalyzer sistema.
Pav. Skirtingų RNR mėginių (eukariotų) RIN reikšmių schema
Tačiau laboratorijose paprastai nėra Agilent 2100 Bioanalyzer.Šiuo atveju galime aptikti per formaldehido gelį, tačiau reikalavimas bendram RNR kiekiui yra didelis, todėl greičiausias būdas yra naudoti įprastą gelio elektroforezę.Būtina būti aplinkoje, kurioje nėra nukleazių, todėl elektroforezės baką, solinį buteliuką, gelio laikiklį ir šukas būtina išplauti DEPC vandeniu.Agarozėje taip pat nėra nukleazės (jei tik ji atidaryta), o įkrovimo buferis turi būti kiek įmanoma šviežiai atidarytas su 1,2 % gelio.
Atkreipkite dėmesį, kad gelis turi būti visiškai ištirpęs, kitaip susidarys nehomogeniškos juostos, kaip parodyta paveikslo 9 pavyzdyje.Jei įtampa yra per aukšta arba veikia per ilgai, ji generuos šilumą ir sukels RNR degradaciją, todėl įtampa ir laikas turi būti kontroliuojami pagrįstai.Be to, gelio paleidimas taip pat gali dar labiau nustatyti, ar mėginyje yra DNR likučių, ir stebėti, ar dozavimo šulinyje yra daug sulaikytų juostų.
Paveikslas.RNR aptikimas gelio elektroforeze
2 Ar esate tikri dėl savo cDNR koncentracijos?
Didžiųjų brolių laboratorijoje patirtis tokia, kad kiekvienos inversijos metu gauta 20 ul sistemos cDNR yra tiesiogiai atskiedžiama 20X, o seserys po doktorantūros – 10X.Dažniausiai priklausau nuo situacijos.Kadangi kiekvieno žmogaus minima RNR kokybė yra skirtinga, skiriasi ir apsisukimo lygis, o atsukimo technologija gali būti nestabili.
Taigi kiekvieną kartą, kai gaunu atvirkštinę cDNR, pirmiausia ją praskiedžiu maždaug 3 kartus, o tada naudoju namų tvarkymo geną, kad atlikčiau RT-PGR, ciklų skaičius paprastai yra 25 ciklai, kad nustatyčiau konkrečią koncentraciją, o tada nustatysiu galutinį praskiedimo koeficientą.
3 Ar esate tikri, kad jūsų gruntus lengva naudoti?
Jis gali įveikti qRT-PGR lydymosi kreivę, tačiau tai vis tiek kainuoja.Laboratorijos, neturinčios daug pinigų, kai jos gauna daug pradmenų, gali naudoti įprastą RT-PGR, kad pamatytų, ar tai viena juosta, ir nustatytų pradmenų specifiškumą.Jei laboratorijai pinigų netrūksta, visų pradmenų specifiškumą galima nustatyti vieną kartą per lydymosi kreivę.
4 Ar esate tikri, kad jūsų eksperimentinės sąlygos yra tinkamos?
SYBR turi būti apsaugotas nuo stiprios šviesos, todėl, pildami SYBR reagentą, stenkitės išjungti viršutinę šviesą, o užbaigti reikia naudoti tik silpną apšvietimą.
SYBR laikyti 4°C temperatūroje.Kai naudojate, švelniai apverskite aukštyn ir žemyn, kad gerai susimaišytų, kad nesuputotų, ir stipriai nemaišykite.
Kai kurios jaunesnės seserys mėgsta piešti žymes ant PGR lentos, bijodamos sumaišyti mėginius, o tai neteisinga.Kadangi labai tikėtina, kad jūsų žymekliai paveiks fluorescencinių signalų rinkimą, aš paprastai jauniesiems rekomenduoju naudoti eksperimentinius užrašų knygeles, kad padėtų atminti, kaip parodyta toliau.
Paveikslas.qRT-PGR mėginio pakrovimo diagrama
5 Ar esate tikri, kad tai darote teisingai?
Būtinai mūvėkite pirštines, mūvėkite pirštines, mūvėkite pirštines ir tris kartus pasakykite svarbius dalykus.
Siekdamas sumažinti SYBR šviesos poveikį, aš asmeniškai norėčiau pirmiausia pridėti šabloną, kaip parodyta paveikslėlyje žemiau.Remiantis patirtimi, pridėjus nedidelį kiekį šablono gali atsirasti atrankos klaidų.Todėl norėdamas sumažinti klaidą, atsirandančią pridedant nedidelį kiekį šablono, aš paprastai vėl padvigubinu mėginį, o pridėdamas mėginį – dvigubai, kad sumažinčiau pridedamo H2O2 kiekį.
Paveikslas.qRT-PCR pakrovimo schema
Tada sukonfigūruokite qRT-PCR sistemą taip.
Paveikslas.qRT-PGR sistemos paruošimo schema
PASTABA: konfigūravimo procesą reikia atlikti ant ledo.
Pridėję mėginį, įklijuokite skaidrią sandarinimo plėvelę.Stenkitės neliesti rankomis permatomos sandarinimo plėvelės paviršiaus, tiesiog valdykite iš abiejų plėvelės pusių esančios vietos.Kadangi pirštų atspaudai taip pat gali turėti įtakos fluorescencinių signalų rinkimui.Tada naudokite centrifugą ir greitai centrifuguokite 10 s mažu greičiu, kad mėginys nekabėtų ant sienos.
Susiję produktai:
Paskelbimo laikas: 2023-04-28
