RT-qPCR sukurtas naudojant įprastą PGR technologiją.Jis prideda fluorescencinių cheminių medžiagų (fluorescencinių dažų arba fluorescencinių zondų) į tradicinę PGR reakcijos sistemą ir realiu laiku aptinka PGR atkaitinimo ir pratęsimo procesą pagal skirtingus jų liuminescencinius mechanizmus.Fluorescencinio signalo pokyčiai terpėje naudojami produkto pasikeitimo dydžiui apskaičiuoti kiekviename PGR cikle.Šiuo metu labiausiai paplitę metodai yra fluorescencinių dažų metodas ir zondo metodas.

Fluorescencinių dažų metodas:
Kai kurie fluorescenciniai dažai, tokie kaip SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO ir kt., patys neskleidžia šviesos, bet skleidžia fluorescenciją po to, kai prisijungia prie nedidelio dsDNR griovelio.Todėl PGR reakcijos pradžioje aparatas negali aptikti fluorescencinio signalo.Kai reakcija pereina į atkaitinimo-pratęsimo (dviejų pakopų metodas) arba prailginimo stadiją (trijų pakopų metodas), šiuo metu atidaromos dvigubos grandinės, o nauja DNR polimerazė.Didėjant PGR ciklų skaičiui, vis daugiau dažų susijungia su dsDNR, o fluorescencinis signalas taip pat nuolat stiprinamas.Paimkite SYBR Green Ⅰ kaip pavyzdį.
Zondas metodas:
Taqman zondas yra dažniausiai naudojamas hidrolizės zondas.5′ zondo gale yra fluorescencinė grupė, dažniausiai FAM.Pats zondas yra seka, papildanti tikslinį geną.Fluoroforo 3′ gale yra fluorescencinė gesinimo grupė.Pagal fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo principą (Förster resonance energy transfer, FRET), kai reporterinė fluorescencinė grupė (donorinė fluorescencinė molekulė) ir gesinanti fluorescencinė grupė (akceptorinė fluorescencinė molekulė) Kai sužadinimo spektras persidengia ir atstumas yra labai arti (7-10 nm) donoro fluorescencijos molekulėje. ule, o autofluorescencija susilpnėja.Todėl PGR reakcijos pradžioje, kai zondas sistemoje yra laisvas ir nepažeistas, reporterio fluorescencinė grupė neskleis fluorescencijos.Atkaitinimo metu gruntas ir zondas prisijungia prie šablono.Prailginimo stadijoje polimerazė nuolat sintezuoja naujas grandines.DNR polimerazė turi 5′-3′ egzonukleazės aktyvumą.Pasiekusi zondą, DNR polimerazė hidrolizuos zondą iš šablono, atskirs reporterio fluorescencinę grupę nuo gesintuvo fluorescencinės grupės ir išleis fluorescencinį signalą.Kadangi tarp zondo ir šablono yra vienas su vienu ryšys, zondo metodas yra pranašesnis už dažymo metodą bandymo tikslumo ir jautrumo požiūriu.

1 pav. qRT-PGR principas

Grunto dizainas
Principai:

Pradmenys turėtų būti sukurti konservuotoje nukleorūgščių serijos srityje ir turėti specifiškumą.

Geriausia naudoti cDNR seką, taip pat priimtina mRNR seka.Jei ne, sužinokite DNR sekos cds srities dizainą.
Fluorescencinio kiekybinio produkto ilgis yra 80–150 bp, ilgiausias yra 300 bp, pradmenų ilgis paprastai yra nuo 17 iki 25 bazių, o skirtumas tarp prieš srovę ir pasroviui esančių pradmenų neturėtų būti per didelis.

G+C kiekis yra nuo 40% iki 60%, o 45–55% yra geriausias.
TM reikšmė yra nuo 58 iki 62 laipsnių.
Stenkitės vengti pradmenų dimerų ir savaiminių dimerų, (neatsirastų daugiau kaip 4 poros iš eilės vienas kitą papildančių bazių) plaukų segtuko struktūra, jei tai neišvengiama, padarykite ΔG<4,5kJ/mol* Jei negalite užtikrinti, kad gDNR buvo pašalinta atvirkštinės transkripcijos metu. Švarus, geriausia projektuoti pradmenis iš introno, modifikuotų, intronų ir sričių, kurių negalima išvengti T, rich gali būti vengiama *3 /C, A/G ištisinės struktūros (2–3) pradmenys ir ne
specifiškas Heterogeniškai amplifikuotos sekos homologija pageidautina yra mažesnė nei 70% arba turi 8 komplementarių bazių homologiją.
Duomenų bazė:
CottonFGD paieška pagal raktinius žodžius
Grunto dizainas:
IDT-qPCR pradmenų dizainas

2 pav. IDT internetinio grunto projektavimo įrankio puslapis

3 pav. rezultatų puslapio rodymas
LncRNR pradmenų dizainas:
lncRNR:tie patys žingsniai kaip ir mRNR.
miRNR:Stem-loop metodo principas: Kadangi visos miRNR yra trumpos apie 23 nt sekos, tiesioginio PGR aptikimo atlikti negalima, todėl naudojamas kamieninės kilpos sekos įrankis.Stiebo kilpos seka yra maždaug 50 nt viengrandė DNR, kuri pati gali sudaryti plaukų segtuko struktūrą.3 Galas gali būti suprojektuotas kaip seka, papildanti miRNR dalinį fragmentą, tada tikslinė miRNR gali būti prijungta prie kamieninės kilpos sekos atvirkštinės transkripcijos metu, o bendras ilgis gali siekti 70 bp, o tai atitinka amplifikuoto produkto ilgį, nustatytą qPCR.Tailing miRNA pradmenų dizainas.
Specifinis amplifikacijos aptikimas:
Internetinė sprogimo duomenų bazė: CottonFGD sprogimas pagal sekos panašumą
Vietinis sprogimas: žr. „Blast+“ naudojimą vietiniam paleidimui, „Linux“ ir „Macos“ gali tiesiogiai sukurti vietinę duomenų bazę, „Win10“ sistemą taip pat galima atlikti įdiegus „ubuntu bash“.Sukurti vietinę sprogimo duomenų bazę ir vietinį sprogimą;atidaryti ubuntu bash ant win10.
Pastaba: Aukštumų ir jūros salų medvilnė yra tetraploidiniai augalai, todėl sprogimo rezultatas dažnai būna du ar daugiau degtukų.Anksčiau naudojant NAU cds kaip duomenų bazę sprogdinimui atlikti, greičiausiai bus rasti du homologiniai genai, turintys tik keletą SNP skirtumų.Paprastai du homologiniai genai negali būti atskirti pagal pradmenų dizainą, todėl jie traktuojami kaip vienodi.Jei yra akivaizdus indelis, pradmuo paprastai projektuojamas ant indelio, tačiau tai gali lemti antrinę pradmenų struktūrą. Laisvoji energija tampa didesnė, todėl amplifikacijos efektyvumas mažėja, tačiau tai neišvengiama.

Grunto antrinės struktūros aptikimas:
Veiksmai:atidaryti oligo 7 → įvesties šablono seka → uždaryti papildomą langą → išsaugoti → rasti pradmenį šablone, paspauskite ctrl+D, kad nustatytumėte pradmenų ilgį → analizuokite įvairias antrines struktūras, pvz., savaiminio dimerizacijos korpusą, heterodimerį, plaukų segtuką, neatitikimą ir kt. Paskutinės dvi nuotraukos 4 paveiksle yra pradmenų bandymo rezultatai.Priekinio grunto rezultatas geras, nėra akivaizdžios dimerio ir plaukų segtuko struktūros, nėra ištisinių viena kitą papildančių bazių, o absoliuti laisvosios energijos vertė yra mažesnė nei 4,5, o užpakalinis gruntas rodo nuolatinį 6 bazės yra viena kitą papildančios, o laisva energija yra 8,8;be to, 3′ gale atsiranda rimtesnis dimeras, atsiranda 4 iš eilės einančių bazių dimeras.Nors laisvoji energija nėra didelė, 3 ′ dimeras Chl gali rimtai paveikti stiprinimo specifiškumą ir stiprinimo efektyvumą.Be to, būtina patikrinti, ar nėra plaukų segtukų, heterodimerų ir neatitikimų.

3 pav. oligo7 aptikimo rezultatai
Stiprinimo efektyvumo aptikimas:
PGR reakcijos amplifikacijos efektyvumas daro didelę įtaką PGR rezultatams.Taip pat qRT-PGR amplifikacijos efektyvumas yra ypač svarbus kiekybiniams rezultatams.Iš reakcijos buferio pašalinkite kitas medžiagas, mašinas ir protokolus.Pradmenų kokybė taip pat turi didelę įtaką qRT-PGR amplifikacijos efektyvumui.Siekiant užtikrinti rezultatų tikslumą, tiek santykinis fluorescencijos kiekybinis nustatymas, tiek absoliutus fluorescencijos kiekybinis įvertinimas turi nustatyti pradmenų amplifikacijos efektyvumą.Pripažįstama, kad efektyvus qRT-PGR amplifikacijos efektyvumas yra nuo 85% iki 115%.Yra du būdai:
1. Standartinės kreivės metodas:
a.Sumaišykite cDNR
b.Gradientinis skiedimas
c.qPCR
d.Tiesinės regresijos lygtis stiprinimo efektyvumui apskaičiuoti
2. LinRegPCR
LinRegPCR yra realaus laiko RT-PGR duomenų, dar vadinamų kiekybiniais PGR (qPCR) duomenimis, analizės programa, pagrįsta SYBR Green ar panašia chemija.Programa naudoja nepataisytus duomenis, kiekvienam mėginiui atskirai atlieka pradinės linijos korekciją, nustato tiesiškumo langą ir tada naudoja tiesinės regresijos analizę, kad PGR duomenų rinkinyje būtų pritaikyta tiesi linija.Pagal šios linijos nuolydį apskaičiuojamas kiekvieno atskiro mėginio PGR efektyvumas.Vidutinis PGR efektyvumas vienam amplikonui ir Ct vertė vienam mėginiui naudojami apskaičiuojant pradinę mėginio koncentraciją, išreikštą savavališkais fluorescencijos vienetais.Duomenų įvestis ir išvestis atliekami naudojant „Excel“ skaičiuoklę.Tik pavyzdys
reikalingas maišymas, nėra gradiento
būtini žingsniai:(Paimkite Bole CFX96 kaip pavyzdį, ne visai mašiną su aiškiu ABI)
eksperimentas:tai standartinis qPCR eksperimentas.
qPCR duomenų išvestis:LinRegPCR gali atpažinti dvi išvesties failų formas: RDML arba kiekybinio stiprinimo rezultatą.Tiesą sakant, tai yra ciklo skaičiaus ir fluorescencinio signalo aptikimo realiuoju laiku vertė, kurią atlieka mašina, o stiprinimas gaunamas analizuojant tiesinio segmento efektyvumo fluorescencijos pokyčio vertę.
Duomenų pasirinkimas: Teoriškai RDML reikšmė turėtų būti tinkama naudoti.Manoma, kad mano kompiuterio problema yra ta, kad programinė įranga negali atpažinti RDML, todėl turiu excel išvesties reikšmę kaip pradinius duomenis.Pirmiausia rekomenduojama atlikti grubų duomenų patikrinimą, pvz., nepavyko pridėti mėginių ir pan. Taškai gali būti ištrinti išvesties duomenyse (žinoma, jūs negalite jų ištrinti, LinRegPCR nepaisys šių taškų vėlesniame etape)

5 pav. qPCR duomenų eksportas

6 pav. kandidatų pavyzdžių pasirinkimas

Duomenų įvedimas:Atidarykite kvalifikacijos stiprinimo rezultatus.xls, → atidarykite LinRegPCR → failą → skaitykite iš Excel → pasirinkite parametrus, kaip parodyta 7 paveiksle → Gerai → spustelėkite nustatyti bazines linijas

7 pav. linRegPCR duomenų įvesties žingsniai

Rezultatas:Jei pasikartojimo nėra, grupuoti nereikia.Jei kartojasi, grupavimą galima redaguoti mėginių grupėje, o į identifikatorių įrašomas geno pavadinimas, tada tas pats genas bus automatiškai sugrupuotas.Galiausiai spustelėkite failą, eksportuokite „Excel“ ir peržiūrėkite rezultatus.Bus rodomas kiekvieno šulinio stiprinimo efektyvumas ir R2 rezultatai.Antra, jei suskirstysite į grupes, bus rodomas pataisytas vidutinis stiprinimo efektyvumas.Įsitikinkite, kad kiekvieno pradmens amplifikacijos efektyvumas yra nuo 85% iki 115%.Jei jis per didelis arba per mažas, tai reiškia, kad pradmens stiprinimo efektyvumas yra prastas.

8 pav. Rezultatas ir duomenų išvestis

Eksperimentinis procesas:
RNR kokybės reikalavimai:
Grynumas:1.72,0 rodo, kad gali būti izotiocianato likučių.Švarios nukleino rūgšties A260/A230 lygis turėtų būti maždaug 2 . Jei 230 nm bangos ilgis yra stipriai sugertas, tai rodo, kad yra organinių junginių, tokių kaip fenato jonai.Be to, jį galima aptikti 1,5% agarozės gelio elektroforeze.Nukreipkite žymeklį, nes ssRNR neturi denatūracijos, o molekulinės masės logaritmas neturi tiesinio ryšio, o molekulinė masė negali būti teisingai išreikšta.Koncentracija: teoriškainemažiau nei 100 ng/ul, jei koncentracija per maža, grynumas paprastai yra žemas, o ne aukštas

9 pav. RNR gelis

Be to, jei mėginys yra brangus ir RNR koncentracija didelė, rekomenduojama jį padalyti po ekstrahavimo ir atskiesti RNR iki galutinės koncentracijos 100-300 ng/ul atvirkštinei transkripcijai.Įatvirkštinės transkripcijos procesas, kai transkribuojama mRNR, atvirkštinei transkripcijai naudojami oligo (dt) pradmenys, kurie gali specifiškai prisijungti prie poliA uodegų, o lncRNR ir cirRNR naudoja atsitiktinius heksamerinius (Random 6 mer) pradmenis visos RNR atvirkštinei transkripcijai.Daugelis kompanijų dabar išleido specialius uodegos rinkinius.Naudojant stiebo kilpos metodą, uodegos metodas yra patogesnis, didelio našumo ir taupantis reagentus, tačiau tos pačios šeimos miRNR atskyrimo efektas neturėtų būti toks geras kaip kamieninės kilpos metodas.Kiekvienas atvirkštinės transkripcijos rinkinys turi specifinių genų pradmenų (kamieninių kilpų) koncentracijos reikalavimus.Vidinė miRNR nuoroda yra U6.Atliekant stiebo kilpos inversiją, U6 vamzdelis turi būti apverstas atskirai, o priekiniai ir galiniai U6 gruntai turi būti pridedami tiesiogiai.Tiek cirRNR, tiek lncRNR gali naudoti HKG kaip vidinę nuorodą.ĮcDNR aptikimas,
jei nėra problemų su RNR, cDNR taip pat turėtų būti gerai.Tačiau jei siekiama eksperimento tobulumo, geriausia naudoti vidinį etaloninį geną (Reference gen, RG), galintį atskirti gDNR nuo CD.Paprastai RG yra namų tvarkymo genas., HKG), kaip parodyta 10 paveiksle;Tuo metu gaminau sojų pupelių baltymus ir kaip vidinę atskaitą naudojau aktino7 turinčius intronus.Šio pradmens amplifikuoto fragmento dydis gDNR buvo 452 bp, o jei cDNR buvo naudojama kaip šablonas, jis buvo 142 bp.Tada bandymo rezultatai parodė, kad dalis cDNR iš tikrųjų buvo užteršta gDNR, taip pat įrodė, kad su atvirkštinės transkripcijos rezultatu nebuvo jokių problemų, todėl jis gali būti naudojamas kaip PGR šablonas.Nenaudinga atlikti agarozės gelio elektroforezę tiesiogiai su cDNR, o tai yra difuzinė juosta, kuri neįtikina.

10 pav. cDNR aptikimas

qPCR sąlygų nustatymasPagal rinkinio protokolą paprastai nėra problemų, daugiausia tm vertės žingsnyje.Jei kai kurie pradmenys nėra tinkamai suprojektuoti pradmenų projektavimo metu, todėl susidaro didelis skirtumas tarp tm vertės ir teorinės 60 °C, rekomenduojama cDNR Sumaišius mėginius, atlikti gradiento PGR su pradmenimis ir stenkitės nenustatyti temperatūros be juostų kaip TM vertės.

Duomenų analizė

Įprastas santykinės fluorescencijos kiekybinis PGR apdorojimo metodas iš esmės atitinka 2-ΔΔCT.Duomenų apdorojimo šablonas.

Susiję produktai:

Realaus laiko PCR lengva^TM – Takmanas

Realaus laiko PCR lengva^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (pagrindinis premiksas pirmosios krypties cDNR sintezei)

RT Easy II (pagrindinis premiksas pirmosios krypties cDNR sintezei qPCR)