Kaip naujovė laboratorijoje, nėra geras darbas išskirti teigiamus augalus iš daugybės augalų, kurių konversijos koeficientas mažas.Pirma, DNR turi būti išgaunama iš daugybės mėginių po vieną, o tada svetimi genai bus aptikti PGR.Tačiau rezultatai dažnai būna tušti ir retkarčiais pateikiamos juostos su keliais elementais, tačiau neįmanoma nustatyti, ar yra praleistų ar klaidingų aptikimų..Ar labai bejėgiška susidurti su tokiu eksperimentiniu procesu ir rezultatais?Nesijaudinkite, brolis moko jus, kaip lengvai ir tiksliai atrinkti transgeninius teigiamus augalus.

1 žingsnis

Dizaino aptikimo gruntai

Pagal tiriamą mėginį nustatykite endogeninį ir egzogeninį geną, kuris turi būti aptiktas, ir pasirinkite tipinę 100–500 bp seką pradmenų projektavimui.Geri pradmenys gali užtikrinti aptikimo rezultatų tikslumą ir sutrumpinti aptikimo laiką (dažniausiai naudojamus aptikimo pradmenis žr. priede).

Pastaba: naujai sukurti pradmenys turi optimizuoti reakcijos sąlygas ir patikrinti aptikimo tikslumą, tikslumą ir aptikimo ribą prieš atliekant didelio masto aptikimą.

2 žingsnis

Projektavimo eksperimentinis protokolas

Teigiama kontrolė: naudokite išgrynintą DNR, kurioje yra tikslinis fragmentas, kaip šabloną, kad nustatytumėte, ar PGR reakcijos sistema ir sąlygos yra normalios.

Neigiama/tuščioji kontrolė: naudokite DNR šabloną arba ddH2O, kuriame nėra tikslinio fragmento, kaip šabloną, kad nustatytumėte, ar PGR sistemoje yra užteršimo šaltinis.

Vidinė kontrolinė kontrolė: naudokite bandinio endogeninio geno pradmenį/zondo derinį, kad įvertintumėte, ar šabloną galima aptikti PGR.

Pastebėti:

Kiekvienam bandymui turi būti nustatytos teigiamos, neigiamos/tuščiosios kontrolės ir vidinės kontrolės kontrolinės medžiagos, kad būtų galima įvertinti eksperimento rezultatų pagrįstumą.

Eksperimento paruošimas

Prieš naudodami patikrinkite, ar tirpalas tolygiai susimaišęs.Jei aptinkama nuosėdų, prieš naudojimą jas reikia ištirpinti ir sumaišyti pagal instrukcijas.Prieš naudojant 2 × PGR mišinį reikia pipete ir pakartotinai maišyti su mikropipete, kad būtų išvengta netolygaus jonų pasiskirstymo.

Pastebėti:

Išimkite vadovą ir atidžiai perskaitykite, o prieš eksperimentą pasiruoškite griežtai laikydamiesi vadovo reikalavimų.

4 veiksmas

Paruoškite PGR reakcijos sistemą

Pagal eksperimentinį protokolą tolygiai sumaišykite pradmenis, H2O ir 2×PGR mišinį, centrifuguokite ir paskirstykite kiekviename reakcijos mėgintuvėlyje.

Pastebėti:

Didelės apimties arba ilgalaikiams tyrimams rekomenduojama naudoti PGR reakcijos sistemą, kurioje yra UNG fermento, kuris gali veiksmingai išvengti PGR produktų sukeliamo aerozolio užteršimo.

5 veiksmas

Pridėkite reakcijos šabloną

Naudojant tiesioginę PGR technologiją, nereikia varginančio nukleorūgščių gryninimo proceso, mėginio šabloną galima paruošti per 10 minučių ir pridėti atitinkamą PGR reakcijos sistemą.

Pastebėti:

Skilimo metodas turi geresnį aptikimo efektą, o gautas produktas gali būti naudojamas kelioms aptikimo reakcijoms.

5.1: Tiesioginis lapų išsiplėtimas

Pagal paveikslėlio dydį instrukcijoje nupjaukite 2-3 mm skersmens lapų audinį ir įdėkite į PGR reakcijos sistemą.

Pastaba: įsitikinkite, kad lapų fragmentai yra visiškai panardinti į PGR reakcijos tirpalą ir nepridėkite per daug lapų audinio.

5.2: Lapų padalijimo metodas

Nupjaukite 5-7 mm skersmens lapų audinį ir įdėkite į centrifugos mėgintuvėlį.Jei renkatės brandžius lapus, nenaudokite pagrindinės lapo gyslos audinių.Pipete įpilkite 50 ul buferinio P1 lizato į centrifugos mėgintuvėlį, kad lizatas visiškai panardintų lapų audinį, įdėkite jį į terminį ciklą arba metalinę vonią ir lizuokite 95 °C temperatūroje 5–10 minučių.

Įpilkite 50 ul Buffer P2 neutralizavimo tirpalo ir gerai išmaišykite.Gautas lizatas gali būti naudojamas kaip šablonas ir pridedamas prie PGR reakcijos sistemos.

Pastaba: šablono kiekis yra 5–10 % PGR sistemos ir neturi viršyti 20 % (pavyzdžiui, į 20 μl PGR sistemą įpilkite 1–2 μl lizės tirpalo, ne daugiau kaip 4 μl).

6 veiksmas

PGR reakcija

Išcentrifugavus PGR reakcijos mėgintuvėlį, jis dedamas į PGR instrumentą amplifikacijai.

Pastebėti:

Reakcijai amplifikacijai naudojamas neišgrynintas šablonas, todėl amplifikacijos ciklų skaičius yra 5-10 ciklų didesnis nei naudojant išgrynintą DNR šabloną.

7 veiksmas

Elektroforezės aptikimas ir rezultatų analizė

M: 100 bp DNR kopėčios

1\4: Išgrynintos DNR metodas

2\5: Tiesioginis PGR metodas

3\6: tuščias valdiklis

QC:

Įvairių kontrolinių elementų, nustatytų eksperimente, bandymų rezultatai turi atitikti šias sąlygas.Priešingu atveju reikia išanalizuoti problemos priežastį ir, pašalinus problemą, atlikti bandymą dar kartą.

1 lentelė. Įvairių kontrolinių grupių įprasti testų rezultatai

*Kai plazmidė naudojama kaip teigiama kontrolė, endogeninio geno tyrimo rezultatas gali būti neigiamas

Rezultatas sprendimas:

A. Mėginio endogeninio geno tyrimo rezultatas yra neigiamas, o tai rodo, kad iš mėginio negalima išskirti įprastam PGR nustatymui tinkamos DNR arba išskirtoje DNR yra PGR reakcijos inhibitorių, todėl DNR reikia ekstrahuoti dar kartą.

B. Mėginio endogeninio geno tyrimo rezultatas yra teigiamas, o egzogeninio – neigiamas, kas rodo, kad iš mėginio išgaunama įprastai PGR aptikimui tinkama DNR ir galima spręsti, kad mėginyje XXX genas neaptiktas.

C. Mėginio endogeninio geno tyrimo rezultatas yra teigiamas, o egzogeninio – teigiamas, o tai rodo, kad iš mėginio buvo išskirta įprastam PGR aptikimui tinkama DNR, o mėginio DNR yra XXX genas.Patvirtinimo eksperimentai gali būti atliekami toliau.

8 veiksmas

Dizaino aptikimo gruntai

Po eksperimento naudokite 2% natrio hipochlorito tirpalą ir 70% etanolio tirpalą, kad nuvalytumėte eksperimento plotą, kad išvengtumėte aplinkos taršos.