Apžvalga
Greitas transgeninių augalų identifikavimas
Tekstas / Tong Yucheng
Eksperimentinė operacija / Han Ying
Redaktorius / Wen Youjun
Žodžiai/1600+
Rekomenduojamas skaitymo laikas/8-10 min
Greitas transgeninių augalų identifikavimas
Kaip naujokas laboratorijoje, nėra geras darbas atrinkti teigiamus augalus iš daugybės augalų, kurių konversijos koeficientas mažas.Pirma, DNR turi būti išgaunama iš daugybės mėginių po vieną, o tada svetimi genai bus aptikti PGR.Tačiau rezultatai dažnai būna tušti ir retkarčiais pateikiamos juostos su keliais elementais, tačiau neįmanoma nustatyti, ar yra praleistų ar klaidingų aptikimų..Ar labai bejėgiška susidurti su tokiu eksperimentiniu procesu ir rezultatais?Nesijaudinkite, brolis moko jus, kaip lengvai ir tiksliai atrinkti transgeninius teigiamus augalus.
1 žingsnis: Dizaino aptikimo gruntai
Pagal tiriamą mėginį nustatykite endogeninį ir egzogeninį geną, kuris turi būti aptiktas, ir pasirinkite tipinę 100–500 bp seką pradmenų projektavimui.Geri pradmenys gali užtikrinti aptikimo rezultatų tikslumą ir sutrumpinti aptikimo laiką (dažniausiai naudojamus aptikimo pradmenis žr. priede).
Pastaba:
Naujai sukurti pradmenys turi optimizuoti reakcijos sąlygas ir patikrinti aptikimo tikslumą, tikslumą ir aptikimo ribą prieš atliekant didelio masto aptikimą.
2 žingsnis:Sukurti eksperimentinį protokolą
Teigiama kontrolė: naudokite išgrynintą DNR, kurioje yra tikslinis fragmentas, kaip šabloną, kad nustatytumėte, ar PGR reakcijos sistema ir sąlygos yra normalios.
Neigiamas / tuščias kontrolė: naudokite DNR šabloną arba ddH2O kuriame nėra tikslinio fragmento kaip šablono, leidžiančio nustatyti, ar PGR sistemoje yra užteršimo šaltinis.
Vidinė kontrolinė kontrolė: naudokite bandinio endogeninio geno pradmenį/zondo derinį, kad įvertintumėte, ar šabloną galima aptikti PGR.
Pastaba:
Kiekvienam bandymui turi būti nustatytos teigiamos, neigiamos/tuščiosios kontrolės ir vidinės kontrolės kontrolinės medžiagos, kad būtų galima įvertinti eksperimento rezultatų pagrįstumą.
3 veiksmas: Eksperimento paruošimas
Prieš naudodami patikrinkite, ar tirpalas tolygiai susimaišęs.Jei aptinkama nuosėdų, prieš naudojimą jas reikia ištirpinti ir sumaišyti pagal instrukcijas.Prieš naudojant 2 × PGR mišinį reikia pipete ir pakartotinai maišyti su mikropipete, kad būtų išvengta netolygaus jonų pasiskirstymo.
Pastaba:
Išimkite instrukcijas ir atidžiai jas perskaitykite, o prieš eksperimentą pasiruoškite griežtai laikydamiesi instrukcijų.
4 žingsnis: Paruoškite PGR reakcijos sistemą
Pagal eksperimentinį protokolą sumaišykite pradmenis, H2O, 2 × PGR sumaišykite, centrifuguokite ir paskirstykite juos kiekviename reakcijos mėgintuvėlyje.
Pastaba:
Didelės apimties arba ilgalaikiams tyrimams rekomenduojama naudoti PGR reakcijos sistemą, kurioje yra UNG fermento, kuris gali veiksmingai išvengti PGR produktų sukeliamo aerozolio užteršimo.
5 veiksmas: pridėkite reakcijos šabloną
Naudojant tiesioginio PGR technologiją, nereikia varginančio nukleorūgščių valymo proceso.Mėginio šabloną galima paruošti per 10 minučių ir įdėti į atitinkamą PGR reakcijos sistemą.
Pastaba:
Lizės metodas turi geresnį aptikimo efektą, o gautas produktas gali būti naudojamas kelioms aptikimo reakcijoms.
5.1: Tiesioginis lapų PGR
Pagal paveikslėlio dydį instrukcijoje nupjaukite 2-3 mm skersmens lapų audinį ir įdėkite į PGR reakcijos sistemą.
Pastaba: įsitikinkite, kad lapų fragmentai yra visiškai panardinti į PGR reakcijos tirpalą ir nepridėkite per daug lapų audinio.
5.2: Lapų lizės metodas
Nupjaukite 5-7 mm skersmens lapų audinį ir įdėkite į centrifugos mėgintuvėlį.Jei renkatės brandžius lapus, nenaudokite pagrindinės lapo gyslos audinių.Pipete įpilkite 50 ul buferinio P1 lizato į centrifugos mėgintuvėlį, kad lizatas visiškai panardintų lapų audinį, įdėkite jį į terminį ciklą arba metalinę vonią ir lizuokite 95 °C temperatūroje 5–10 minučių.
Įpilkite 50 ul Buffer P2 neutralizavimo tirpalo ir gerai išmaišykite.Gautas lizatas gali būti naudojamas kaip šablonas ir pridedamas prie PGR reakcijos sistemos.
Pastaba: šablono kiekis turi būti 5–10 % PGR sistemos ir neturi viršyti 20 % (pavyzdžiui, į 20 μl PGR sistemą įpilkite 1–2 μl lizės buferio, ne daugiau kaip 4 μl).
6 veiksmas: PGR reakcija
Centrifugavę PGR reakcijos mėgintuvėlį, įdėkite juos į PGR instrumentą amplifikacijai.
Pastaba:
Reakcijai amplifikacijai naudojamas neišgrynintas šablonas, todėl amplifikacijos ciklų skaičius yra 5-10 ciklų didesnis nei naudojant išgrynintą DNR šabloną.
7 veiksmas: elektroforezės aptikimas ir rezultatų analizė
M: 100 bp DNR kopėčios
1\4: Išgrynintos DNR metodas
2\5: Tiesioginis PGR metodas
3\6: tuščias valdiklis
Kokybės kontrolė:
Įvairių kontrolinių elementų, nustatytų eksperimente, tyrimo rezultatai turi atitikti šias sąlygas.Priešingu atveju reikia išanalizuoti problemos priežastį ir, pašalinus problemą, atlikti bandymą dar kartą.
1 lentelė. Įvairių kontrolinių grupių įprasti testų rezultatai
*Kai plazmidė naudojama kaip teigiama kontrolė, endogeninio geno tyrimo rezultatas gali būti neigiamas
Rezultatas sprendimas:
A. Mėginio endogeninio geno tyrimo rezultatas yra neigiamas, o tai rodo, kad iš mėginio negalima išskirti įprastam PGR nustatymui tinkamos DNR arba išskirtoje DNR yra PGR reakcijos inhibitorių, todėl DNR reikia ekstrahuoti dar kartą.
B. Mėginio endogeninio geno tyrimo rezultatas yra teigiamas, o egzogeninio – neigiamas, tai rodo, kad iš mėginio yra išskirta įprastam PGR nustatymui tinkama DNR ir galima spręsti, kad mėginyje XXX genas neaptiktas.
C. Mėginio endogeninio geno tyrimo rezultatas yra teigiamas, o egzogeninio – teigiamas, tai rodo, kad iš mėginio buvo išskirta įprastam PGR nustatymui tinkama DNR, o mėginio DNR yra XXX genas.Patvirtinimo eksperimentai gali būti atliekami toliau.
8 veiksmas: suprojektuokite aptikimo pradmenis
Po eksperimento naudokite 2% natrio hipochlorito tirpalą ir 70% etanolio tirpalą, kad nuvalytumėte eksperimento plotą, kad išvengtumėte aplinkos taršos.
Priedas
2 lentelė. Dažniausiai naudojami pradmenys genetiškai modifikuotų augalų bendram PGR aptikimui
Nuorodinis dokumentas:
SN/T 1202-2010, Kokybinis PGR nustatymo metodas genetiškai modifikuotiems augaliniams ingredientams maiste.
Žemės ūkio ministerijos pranešimas 1485-5-2010, Genetiškai modifikuotų augalų ir jų produktų ingredientų – ryžių M12 ir jų darinių – tyrimai.
Paskelbimo laikas: 2021-09-09
