一、Padidinkite reakcijos sistemos jautrumą:

1. Išskirkite aukštos kokybės RNR:

Sėkmingą cDNR sintezę užtikrina aukštos kokybės RNR.Aukštos kokybės RNR turi būti bent jau viso ilgio ir be atvirkštinės transkriptazės inhibitorių, tokių kaip EDTA ar SDS.RNR kokybė lemia maksimalų sekos informacijos kiekį, kurį galite perrašyti į cDNR.Įprastas RNR gryninimo metodas yra vieno etapo metodas, naudojant guanidino izotiocianatą / rūgštinį fenolį.Kad būtų išvengta užteršimo nedideliais RNazės kiekiais, RNR, išskirta iš RNazės turtingų mėginių (pvz., Kasos), turi būti laikoma formaldehide, kad būtų išsaugota aukštos kokybės RNR, ypač ilgalaikiam saugojimui.RNR, išskirta iš žiurkės kepenų, iš esmės suyra po savaitės laikymo vandenyje, o iš žiurkės blužnies išgauta RNR išliko stabili po 3 metų laikymo vandenyje.Be to, ilgesni nei 4 kb nuorašai yra jautresni RNazių degradacijai nei maži nuorašai.Siekiant padidinti saugomų RNR mėginių stabilumą, RNR galima ištirpinti dejonizuotame formamide ir laikyti -70°C temperatūroje.RNR konservavimui naudojamas formamidas turi būti be RNR ardančių šiukšlių.RNR iš kasos gali būti išsaugota formamide mažiausiai vienerius metus.Ruošiantis naudoti RNR, RNR nusodinimui galite naudoti tokį metodą: įpilkite NaCl iki 0,2 M ir 4 kartus didesnio tūrio etanolio, padėkite į kambario temperatūrą 3-5 minutes ir centrifuguokite 10 000 × g 5 minutes.

2. Naudokite RNaseH neaktyvią (RNaseH-) atvirkštinę transkriptazę:

Rnazės inhibitoriai dažnai pridedami prie atvirkštinės transkripcijos reakcijos, siekiant padidinti cDNR sintezės trukmę ir išeigą.Rnazės inhibitoriai turėtų būti pridedami pirmosios grandinės sintezės reakcijos metu, dalyvaujant buferiui ir redukuojančiam agentui (pvz., DTT), nes prieš cDNR sintezę vykstantis procesas denatūruoja inhibitorių, taip išlaisvindamas surištą Rnazę, kuri gali skaidyti RNR.Baltymų RNazės inhibitoriai tik užkerta kelią RNR skaidymui RNazei A, B, C ir neapsaugo nuo RNazės ant odos, todėl būkite atsargūs, kad RNazė nepatektų iš pirštų, nepaisant šių inhibitorių naudojimo.

Atvirkštinė transkriptazė katalizuoja RNR pavertimą cDNR.Tiek M-MLV, tiek AMV, be savo polimerazės aktyvumo, turi endogeninį RNaseH aktyvumą.RNaseH aktyvumas ir polimerazės aktyvumas konkuruoja tarpusavyje dėl hibridinės grandinės, susidariusios tarp RNR šablono ir DNR pradmens arba cDNR pratęsimo grandinės, ir suardo RNR grandinę RNR:DNR komplekse.RNR šablonas, suardytas dėl RNaseH aktyvumo, nebegali būti veiksmingas cDNR sintezės substratas, todėl sumažėja cDNR sintezės išeiga ir trukmė.Todėl būtų naudinga panaikinti arba labai sumažinti atvirkštinės transkriptazės RNazeH aktyvumą.

SuperScript Ⅱ atvirkštinė transkriptazė, RNaseH-MMLV atvirkštinė transkriptazė ir termoScript atvirkštinė transkriptazė, RNaseH-AMV, gali gauti daugiau ir daugiau viso ilgio cDNR nei MMLV ir AMV.RT-PGR jautrumą paveiks cDNR sintezės kiekis.ThermoScript yra daug jautresnis nei AMV.RT-PGR produktų dydį riboja atvirkštinės transkriptazės gebėjimas sintetinti kDNR, ypač klonuojant didesnes cDNR.Palyginti su MMLV, SuperScripⅡ žymiai padidino ilgų RT-PCR produktų išeigą.RNaseH-atvirkštinė transkriptazė taip pat turi didesnį termostabilumą, todėl reakciją galima atlikti aukštesnėje nei įprasta 37-42°C temperatūroje.Siūlomomis sintezės sąlygomis naudokite oligo(dT) pradmenį ir 10 μCi [α-P]dCTP.Bendras pirmosios gijos derlius buvo apskaičiuotas naudojant TCA nusodinimo metodą.Viso ilgio cDNR buvo analizuojama naudojant pagal dydį surūšiuotas juostas, iškirptas ir suskaičiuotas šarminiame agarozės gelyje.

3. Padidinkite inkubacijos temperatūrą atvirkštinei transkripcijai:

Aukštesnė inkubacijos temperatūra padeda atverti RNR antrinę struktūrą, padidindama reakcijos išeigą.Daugumos RNR šablonų RNR ir pradmenų inkubavimas 65 °C temperatūroje be buferio ar druskos, po to greitai aušinamas ant ledo, pašalins daugumą antrinių struktūrų ir leis pradmenims prisijungti.Tačiau kai kurie šablonai vis dar turi antrines struktūras, net ir po terminio denatūravimo.Šių sudėtingų šablonų amplifikaciją galima atlikti naudojant ThermoScript atvirkštinę transkriptazę ir atvirkštinės transkripcijos reakciją pateikus aukštesnėje temperatūroje, kad pagerėtų amplifikacija.Aukštesnė inkubavimo temperatūra taip pat gali padidinti specifiškumą, ypač kai cDNR sintezei naudojami genų specifiniai pradmenys (GSP) (žr. 3 skyrių).Jei naudojate GSP, įsitikinkite, kad pradmenų Tm yra tokia pati kaip numatoma inkubavimo temperatūra.Nenaudokite oligo(dT) ir atsitiktinių pradmenų, kurių temperatūra viršija 60°C.Atsitiktinius pradmenis reikia inkubuoti 25 °C temperatūroje 10 minučių, o po to padidinti iki 60 °C.Be to, kad naudojama aukštesnė atvirkštinės transkripcijos temperatūra, specifiškumas taip pat gali būti pagerintas tiesiogiai perkeliant RNR ir pradmenų mišinį iš 65 °C denatūravimo temperatūros į atvirkštinės transkripcijos inkubacijos temperatūrą ir pridedant iš anksto pašildyto 2 × reakcijos mišinio (cDNR karšto paleidimo sintezė).Šis metodas padeda išvengti tarpmolekulinių bazių poravimosi, kuris vyksta žemesnėje temperatūroje.Keli temperatūros perjungimai, reikalingi RT-PGR, gali būti supaprastinti naudojant terminį ciklą.

Tth termostabili polimerazė veikia kaip DNR polimerazė esant Mg2+ ir kaip RNR polimerazė esant Mn2+.Galima laikyti šiltai ne aukštesnėje kaip 65°C temperatūroje.Tačiau Mn2+ buvimas PGR metu sumažina tikslumą, todėl Tth polimerazė yra mažiau tinkama didelio tikslumo amplifikacijai, pavyzdžiui, cDNR klonavimui.Be to, Tth turi mažą atvirkštinės transkripcijos efektyvumą, o tai sumažina jautrumą, o kadangi atvirkštinė transkripcija ir PGR gali būti atliekami su vienu fermentu, kontrolinės reakcijos be atvirkštinės transkripcijos negali būti naudojamos kDNR amplifikacijos produktams palyginti su užteršiančia genomo DNR.Amplifikacijos produktai buvo atskirti.

4. Priedai, skatinantys atvirkštinę transkripciją:

Į pirmosios grandinės sintezės reakciją pridedami priedai, įskaitant glicerolį ir DMSO, kurie gali sumažinti nukleino rūgšties dvigubos grandinės stabilumą ir atsieti antrinę RNR struktūrą.Galima pridėti iki 20 % glicerolio arba 10 % DMSO nepažeidžiant SuperScript II arba MMLV aktyvumo.AMV taip pat gali toleruoti iki 20% glicerolio neprarandant aktyvumo.Siekiant maksimaliai padidinti RT-PGR jautrumą SuperScriptⅡ atvirkštinės transkripcijos reakcijoje, galima pridėti 10% glicerolio ir inkubuoti 45 °C temperatūroje.Jei į PGR pridedama 1/10 atvirkštinės transkripcijos reakcijos produkto, tai glicerolio koncentracija amplifikacijos reakcijoje yra 0,4%, o to nepakanka PGR slopinti.

5. RNaseH gydymas:

cDNR sintezės reakcijų gydymas RNazeH prieš PGR gali padidinti jautrumą.Kai kurių šablonų atveju manoma, kad RNR cDNR sintezės reakcijoje neleidžia prisijungti prie amplifikacijos produktų, tokiu atveju gydymas RNazeH gali padidinti jautrumą.Paprastai gydymas RNaseH yra būtinas amplifikuojant ilgesnius viso ilgio cDNR tikslinius šablonus, tokius kaip mažos kopijos gumbinė scherozė II.Šiam sudėtingam šablonui gydymas RNaseH sustiprino signalą, kurį gamina SuperScript II arba AMV sintezuota cDNR.Daugumoje RT-PGR reakcijų gydymas RNazeH yra neprivalomas, nes PGR denatūravimo etapas 95 °C temperatūroje paprastai hidrolizuoja RNR RNR:DNR komplekse.

6. Mažos RNR aptikimo metodo tobulinimas:

RT-PGR yra ypač sudėtingas, kai yra tik nedidelis RNR kiekis.Glikogenas, pridėtas kaip nešiklis RNR išskyrimo metu, padeda padidinti mažų mėginių išeigą.RNazės neturinčio glikogeno galima pridėti tuo pačiu metu, kaip ir Trizol.Glikogenas yra tirpus vandenyje ir gali būti laikomas vandeninėje fazėje su RNR, kad būtų lengviau nusodinti.Mėginiams, kuriuose yra mažiau nei 50 mg audinių arba 106 kultivuotų ląstelių, rekomenduojama glikogeno be RNazės koncentracija yra 250 μg/ml.

Acetilinto BSA pridėjimas prie atvirkštinės transkripcijos reakcijos naudojant SuperScript II gali padidinti jautrumą, o esant nedideliam RNR kiekiui, sumažinus SuperScript II kiekį ir pridėjus 40 vienetų RNaseOut nukleazės inhibitoriaus, gali padidėti aptikimo lygis.Jei RNR išskyrimo procese naudojamas glikogenas, naudojant SuperScript II atvirkštinės transkripcijos reakcijai, vis tiek rekomenduojama pridėti BSA arba RNazės inhibitorių.

Padidinkite RT-PCR specifiškumą

1. CND sintezė:

Pirmosios grandinės cDNR sintezė gali būti inicijuota naudojant tris skirtingus metodus, kurių santykinis specifiškumas turi įtakos susintetintos cDNR kiekiui ir tipui.

Atsitiktinis pradmenų metodas buvo mažiausiai specifinis iš trijų metodų.Pradmenys susilieja keliose transkripto vietose, generuodami trumpas, dalinio ilgio cDNR.Šis metodas dažnai naudojamas norint gauti 5′ galo sekas ir gauti cDNR iš RNR šablonų su antrinės struktūros sritimis arba galinėmis vietomis, kurių negalima replikuoti atvirkštine transkriptaze.Norint gauti ilgiausią kDNR, kiekviename RNR mėginyje reikia empiriškai nustatyti pradmenų ir RNR santykį.Pradinė atsitiktinių pradmenų koncentracija svyravo nuo 50 iki 250 ng 20 μl reakcijai.Kadangi cDNR, susintetinta iš visos RNR naudojant atsitiktinius pradmenis, pirmiausia yra ribosominė RNR, poli(A)+RNR paprastai pasirenkama kaip šablonas.

Oligo(dT) pradmenys yra specifiškesni nei atsitiktiniai pradmenys.Jis hibridizuojasi su poli(A) uodega, esančia daugumos eukariotų mRNR 3′ gale.Kadangi poli(A)+ RNR sudaro maždaug 1–2 % visos RNR, cDNR kiekis ir sudėtingumas yra daug mažesnis nei naudojant atsitiktinius pradmenis.Dėl didelio specifiškumo oligo(dT) paprastai nereikalauja optimizuoti RNR santykio su pradmenimis ir poli(A)+ atrankos.Rekomenduojama naudoti 0,5 μg oligo(dT) 20 μl reakcijos sistemoje.oligo(dT)12-18 tinka daugumai RT-PGR.ThermoScript RT-PCR sistema siūlo oligo(dT)20 dėl geresnio terminio stabilumo esant aukštesnei inkubacijos temperatūrai.

Genų specifiniai pradmenys (GSP) yra specifiškiausi atvirkštinės transkripcijos etapo pradmenys.GSP yra antisensinis oligonukleotidas, galintis specifiškai hibridizuotis su RNR tiksline seka, skirtingai nei atsitiktiniai pradmenys arba oligo(dT), kurie prisijungia prie visų RNR.Tos pačios taisyklės, naudojamos projektuojant PGR pradmenis, taikomos ir GSP projektavimui atvirkštinės transkripcijos reakcijose.GSP gali būti ta pati seka kaip amplifikacinis pradmuo, kuris prisijungia prie 3′-pačiausio mRNR galo, arba GSP gali būti sukurtas taip, kad prisijungtų pasroviui nuo atvirkštinės amplifikacijos pradmenų.Kai kuriems amplifikuotiems subjektams, norint sėkmingai atlikti RT-PGR, reikia sukurti daugiau nei vieną antisensinį pradmenį, nes antrinė tikslinės RNR struktūra gali užkirsti kelią pradmenų surišimui.20 μl pirmosios grandinės sintezės reakcijoje rekomenduojama naudoti 1 pmol antisense GSP.

2. Padidinkite inkubacijos temperatūrą atvirkštinei transkripcijai:

Norint išnaudoti visus GSP specifiškumo privalumus, reikia naudoti atvirkštinę transkriptazę su didesniu termostabilumu.Termostabilios atvirkštinės transkriptazės gali būti inkubuojamos aukštesnėje temperatūroje, kad padidėtų reakcijos griežtumas.Pavyzdžiui, jei GSP atkaitinama 55 ° C temperatūroje, GSP specifiškumas nebus visiškai išnaudotas, jei AMV arba M-MLV bus naudojamas atvirkštinei transkripcijai esant žemam 37 ° C griežtumui.Tačiau „SuperScript II“ ir „ThermoScript“ gali reaguoti esant 50°C ar aukštesnei temperatūrai, o tai pašalins nespecifinius produktus, susidarančius žemesnėje temperatūroje.Siekiant maksimalaus specifiškumo, RNR ir pradmenų mišinys gali būti tiesiogiai perkeltas iš 65 °C denatūravimo temperatūros į atvirkštinės transkripcijos inkubavimo temperatūrą ir pridedamas prie iš anksto pašildyto 2 × reakcijos mišinio (cDNR sintezės karštasis paleidimas).Tai padeda išvengti tarpmolekulinių bazių poravimosi žemoje temperatūroje.Keli temperatūros perėjimai, reikalingi RT-PGR, gali būti supaprastinti naudojant terminį ciklą.

3. Sumažina genomo DNR užterštumą:

Galimas sunkumas, su kuriuo susiduria RT-PGR, yra genominės DNR užteršimas RNR.Naudojant gerą RNR išskyrimo metodą, pvz., Trizol Reagent, sumažės genominės DNR, užteršiančios RNR preparatą, kiekis.Siekiant išvengti produktų, gautų iš genominės DNR, RNR gali būti apdorojama amplifikacijos laipsnio DNaze I, kad būtų pašalinta užteršianti DNR prieš atvirkštinę transkripciją.DNazės I virškinimas buvo nutrauktas inkubuojant mėginius 2,0 mM EDTA 10 minučių 65 °C temperatūroje.EDTA gali sudaryti magnio jonų chelatą, užkertant kelią magnio jonų priklausomai RNR hidrolizei aukštoje temperatūroje.

Siekiant atskirti amplifikuotą cDNR nuo užterštų genominės DNR amplifikacijos produktų, gali būti sukurti pradmenys, kurių kiekvienas susilieja su atskirais egzonais.PGR produktai, gauti iš cDNR, bus trumpesni nei tie, gauti iš užterštos genominės DNR.Be to, kiekvienam RNR šablonui buvo atliktas kontrolinis eksperimentas be atvirkštinės transkripcijos, siekiant nustatyti, ar tam tikras fragmentas buvo gautas iš genominės DNR ar cDNR.PGR produktas, gautas be atvirkštinės transkripcijos, yra gautas iš genomo.