Ⅰ. Padidinkite reakcijos sistemos jautrumą:
1. Atskirkite aukštos kokybės RNR:
Sėkmingą cDNR sintezę užtikrina aukštos kokybės RNR.Aukštos kokybės RNR turėtų užtikrinti bent jau ilgiau ir joje neturi būti inhibitorių, kuriuose nėra registruojančių fermentų, tokių kaip EDTA ar SDS.RNR kokybė lemia didžiausią sekos informacijos, kurią galite perrašyti į cDNR, vertę.Bendrasis RNR gryninimo metodas yra pakopinis izoocianato/acidofenolio naudojimo metodas.Siekiant išvengti RNazės užteršimo, RNR, atskirtai nuo mėginio, kuriame gausu RNazės (pvz., Kasos), reikia laikyti formaldehidą, kad būtų išsaugota aukštos kokybės RNR, o tai dar labiau reikalinga ilgalaikiam saugojimui.RNR, išskirta iš žiurkės kepenų, iš esmės buvo suskaidyta po savaitės laikymo vandenyje, o iš žiurkės blužnies išskirta RNR išliko stabili po trejų metų laikymo vandenyje.Be to, didesni nei 4 kb nuorašai yra jautresni RNazės degradacijos pėdsakams nei maži nuorašai.Siekiant padidinti saugomo RNR mėginio stabilumą, RNR gali būti ištirpinta jonų metalmamine ir laikoma -70 °C.Tilidas, naudojamas RNR išsaugoti, neturi turėti įvairių objektų, kurie ardytų RNR.RNR, gaunama iš kasos, gali būti saugoma metalmamine mažiausiai vienerius metus.Kai būsite pasiruošę naudoti RNR, RNR nusodinimui galite naudoti šiuos metodus: įpilkite NaCl iki 0,2 m ir 4 kartus didesnio etanolio tūrio, palaikykite kambario temperatūroje 3–5 minutes ir 10 000 × g išcentrinę 5 minutes.
2. Naudokite atvirkštinę transkriptazę be RNaseH aktyvumo (RNaseH-)
Rnazės inhibitoriai dažnai pridedami prie atvirkštinės transkripcijos reakcijos, siekiant padidinti cDNR sintezės trukmę ir išeigą.Rnazės inhibitorius pridedamas pirmoje grandinės sintezės reakcijoje, dalyvaujant buferiams ir redukuojantiems agentams, tokiems kaip DTT, nes prieš-cDNR sintezės procesas denatūruoja inhibitorių, taip išlaisvindamas surištas RNazes, kurios skaido RNR.Baltymų RNazės inhibitorius tik apsaugo nuo RNR skaidymo RNazės A, B, C ir neapsaugo nuo RNazių ant odos, todėl reikia pasirūpinti, kad RNazės nepatektų iš pirštų, nepaisant šių inhibitorių naudojimo.
Atvirkštinė transkriptazė katalizuoja RNR pavertimą cDNR.Tiek M-MLV, tiek AMV, be savo polimerazės aktyvumo, turi endogeninį RNaseH aktyvumą.RNaseH aktyvumas konkuruoja su polimerazės aktyvumu dėl heterozigotinių grandinių, susidarančių tarp RNR šablonų ir DNR pradmenų arba cDNR pratęsimo grandinių, ir skaido RNR: RNR grandines DNR kompleksuose.RNR šablonai, suskaidyti dėl RNaseH aktyvumo, nebegali būti naudojami kaip veiksmingi cDNR sintezės substratai, todėl sumažėja cDNR sintezės išeiga ir trukmė.Taigi atvirkštinės transkriptazės RNaseH aktyvumo pašalinimas arba labai sumažinimas būtų labai naudingas.
SuperScriptⅡ atvirkštinė transkriptazė, MMLV atvirkštinė RNaseH transkriptazė ir thermoScript atvirkštinė transkriptazė, RNaseH AMV davė daugiau viso ilgio cDNR nei MMLV ir AMV.RT-PGR jautrumą veikia susintetintos cDNR kiekis.ThermoScript yra daug jautresnis nei AMV.RT-PGR produktų dydį riboja atvirkštinės transkriptazės gebėjimas sintetinti cDNR, ypač klonuojant didesnes Cdnas.Palyginti su MMLV, SuperScripⅡ žymiai padidino ilgų RT-PCR produktų išeigą.RNaseH- atvirkštinė transkriptazė taip pat padidina šiluminį stabilumą, todėl reakcija gali būti vykdoma aukštesnėje nei įprasta 37-42 ℃ temperatūroje.Siūlomomis sintezės sąlygomis buvo naudojami oligo (dT) pradmenys ir 10 μCi [alfa-p] dCTP.Bendra pirmosios grandinės produkcija buvo apskaičiuota naudojant TCA nusodinimo metodą.Viso ilgio cDNR buvo analizuojama, pašalinant juostelę pagal dydį ir skaičiuojant šarminiame agarozės gelyje.
3. Padidinkite atvirkštinės transkripcijos šilumos išsaugojimo temperatūrą:
Aukštesnė laikymo temperatūra padeda atverti antrinę RNR struktūrą ir padidinti reakcijos išeigą.Daugumos RNR šablonų atveju, laikant RNR ir pradmenį 65 °C temperatūroje be buferio ar druskos ir greitai atvėsinant ant ledo, dauguma antrinių struktūrų pašalinamos ir pradmenys gali susijungti.Tačiau kai kurie šablonai vis dar turi antrinę struktūrą, net ir po terminės denatūracijos.Šių sudėtingų šablonų amplifikacija gali būti atliekama naudojant ThermoScript atvirkštinę transkriptazę ir atvirkštinės transkriptazės reakciją nustatant aukštesnėje temperatūroje, kad pagerėtų amplifikacija.Aukštesnė laikymo temperatūra taip pat gali padidinti specifiškumą, ypač kai cDNR sintezė atliekama naudojant genų specifinius pradmenis (GSPS) (žr. 3 skyrių).Jei naudojate GSP, įsitikinkite, kad grunto Tm vertė yra tokia pati kaip numatoma laikymo temperatūra.Nenaudokite oligo(dT) ir atsitiktinių pradmenų, kurių temperatūra viršija 60 ℃.Atsitiktiniai pradmenys turi būti laikomi 25 ℃ temperatūroje 10 minučių, prieš padidindami iki 60 ℃.Be aukštesnių atvirkštinės transkripcijos temperatūrų naudojimo, specifiškumas gali būti pagerintas tiesiogiai perkeliant RNR / pradmenų mišinį iš 65 ℃ denatūravimo temperatūros į atvirkštinės transkripcijos laikymo temperatūrą ir pridedant iš anksto pašildyto 2 × reakcijos mišinio (cDNR terminės iniciacijos sintezė).Šis metodas padeda išvengti tarpmolekulinių bazių poravimosi, kuris vyksta žemesnėje temperatūroje.Naudojant PGR instrumentą, supaprastinama daugybė temperatūros jungiklių, reikalingų RT-PGR.
Tth termiškai stabilizuota polimerazė veikia kaip DNR polimerazė, esant Mg2+, ir RNR polimerazė, esant Mn2+.Jis gali išlaikyti šilumą iki 65 ℃.Tačiau Mn2+ buvimas PGR metu sumažina tikslumą, todėl Tth polimerazė yra mažiau tinkama didelio tikslumo amplifikacijai, pavyzdžiui, cDNR klonavimui.Be to, Tth yra mažiau veiksmingas atvirkštinės transkripcijos metu, o tai sumažina jautrumą, o kadangi vienas fermentas gali atlikti atvirkštinę transkripciją ir PGR, kontrolinės reakcijos be atvirkštinės transkripcijos negali būti naudojamos siekiant atskirti amplifikuotus cDNR produktus nuo užterštos genominės DNR.
4. Priedas, skatinantis atvirkštinę transkripciją:
Pridėjus priedų, įskaitant gliceriną ir DMSO, į pirmąją grandinės sintezės reakciją, gali sumažėti nukleino rūgšties dvigubos grandinės stabilumas ir išvynioti RNR antrinė struktūra.Galima pridėti iki 20 % glicerino arba 10 % DMSO, nepažeidžiant SuperScriptⅡ ar MMLV aktyvumo.AMV taip pat gali toleruoti iki 20% glicerolio nesumažindamas aktyvumo.Norint maksimaliai padidinti RT-PGR jautrumą SuperScriptⅡ atvirkštinės transkripcijos reakcijoje, galima pridėti 10% glicerolio ir izoliuoti esant 45 ℃.Jei į PGR pridedama 1/10 retrotranskripcijos-reakcijos produkto, glicerolio koncentracija amplifikacijos reakcijoje yra 0,4%, o to nepakanka PGR slopinimui.
5. RNaseH apdorojimas:
Jautrumą galima pagerinti prieš PGR apdorojant cDNR sintezės reakcijas RNazeH.Kai kurių šablonų atveju manoma, kad RNR cDNR sintezės reakcijoje neleidžia prisijungti prie amplifikuotų produktų, tokiu atveju gydymas RNazeH gali padidinti jautrumą.Paprastai gydymas RNaseH reikalingas santykinai ilgam viso ilgio cDNR tikslinio šablono amplifikacijai, pavyzdžiui, gumbinei scherozeiⅡ su maža kopija.Šiam sudėtingam šablonui RNaseH sustiprino signalą, kurį generuoja cDNR, susintetinta SuperScriptⅡ arba AMV.Daugeliui RT-PGR reakcijų gydymas RNazeH yra neprivalomas, nes 95 ℃ izoliuotas PGR denatūravimo etapas paprastai hidrolizuoja RNR iš RNR: DNR komplekso.
6. Patobulinti mažų RNR kiekių aptikimo metodai:
RT-PGR yra ypač sudėtingas, kai yra tik nedidelis RNR kiekis.Glikogeno kaip nešiklio pridėjimas RNR atskyrimo metu padeda padidinti mažų mėginių išeigą.Kartu su Trizol galima pridėti glikogeno be RNazės.Glikogenas yra tirpus vandenyje ir gali likti vandens fazėje su RNR, kad padėtų vėliau nusodinti.Rekomenduojama glikogeno be RNazės koncentracija yra 250 μg/ml mėginiuose, kuriuose yra mažiau nei 50 mg audinių arba 106 kultivuotų ląstelių.
Acetilinto BSA pridėjimas prie atvirkštinės transkripcijos reakcijos naudojant SuperScriptⅡ gali padidinti jautrumą, o esant nedideliam RNR kiekiui, sumažinus SuperScriptⅡ kiekį ir pridėjus 40 vienetų RnaseOut nukleazės inhibitoriaus, gali pagerėti aptikimo lygis.Jei RNR atskyrimui naudojamas glikogenas, prie atvirkštinės transkripcijos reakcijos naudojant SuperScriptⅡ vis tiek rekomenduojama pridėti BSA arba RNazės inhibitorių.
Ⅱ. Padidinkite RT-PGR specifiškumą
1. cNDA sintezė:
Pirmosios grandinės cDNR sintezei inicijuoti gali būti naudojami trys skirtingi metodai, o santykinis kiekvieno metodo specifiškumas turi įtakos susintetintos cDNR kiekiui ir tipui.
Atsitiktinis pradmenų metodas yra mažiausiai specifinis iš trijų metodų.Pradmenys yra atkaitinami keliose transkripto vietose, kad būtų gauta trumpa, dalinio ilgio cDNR.Šis metodas dažnai naudojamas norint gauti 5′ galines sekas ir cDNR iš RNR šablonų su antrinėmis struktūrinėmis sritimis arba baigiamomis vietomis, kurių atvirkštinė transkriptazė negali replikuotis.Norint gauti ilgiausią kDNR, kiekviename RNR mėginyje reikia empiriškai nustatyti pradmenų ir RNR santykį.Pradinė atsitiktinių pradmenų koncentracija svyruoja nuo 50 iki 250 ng 20 μl reakcijos sistemoje.Kadangi cDNR, susintetinta iš visos RNR, naudojant atsitiktinius pradmenis, daugiausia yra ribosominė RNR, poli(A)+RNR paprastai pasirenkama kaip šablonas.
Oligo(dT) iniciacija yra specifiškesnė nei atsitiktiniai pradmenys.Jis hibridizuojasi su poli(A) uodega, esančia daugumoje eukariotinių ląstelių mRNR 3′ gale.Kadangi poli(A)+RNR sudaro maždaug 1–2 % visos RNR, cDNR kiekis ir sudėtingumas yra daug mažesnis nei naudojant atsitiktinius pradmenis.Dėl didelio specifiškumo oligo(dT) paprastai nereikalauja optimizuoti RNR ir pradmenų santykio ir poli(A)+ atrankos.Rekomenduojama naudoti 0,5 μg oligo(dT) 20 μl reakcijos sistemoje.oligo(dT)12-18 tinka daugumai RT-PGR.ThermoScript RT-PCR sistema užtikrina oligo(dT)20 dėl gero terminio stabilumo ir tinka aukštesnėms laikymo temperatūroms.
Genų specifiniai pradmenys (GSP) yra geriausi specifiniai pradmenys atvirkštinės transkripcijos etapui.GSP yra antisensinis oligonukleozidas, galintis specifiškai hibridizuotis su RNR paskirties sekomis, o ne sujungti visas RNR, kaip atsitiktiniai pradmenys arba oligo(dT).Taisyklės, naudojamos kuriant PGR pradmenis, taip pat taikomos projektuojant atvirkštinės transkripcijos reakcijos GSP.GSP gali būti tokia pati seka kaip amplifikacijos pradmuo, prijungtas prie mRNR3′ pabaigos, arba GSP gali būti sukurtas taip, kad būtų sujungtas pasroviui su atvirkštinio amplifikacijos pradmeniu.Sėkmingam RT-PGR kai kuriems amplifikuotiems objektams būtina sukurti daugiau nei vieną antisensinį pradmenį, nes antrinė tikslinės RNR struktūra gali neleisti pradmeniui prisijungti.Pirmoje grandinės sintezės reakcijos sistemoje 20 μl siūloma naudoti 1 pmol antisensinį GSP.
2. Padidinkite atvirkštinės transkripcijos šilumos išsaugojimo temperatūrą:
Norint visiškai išnaudoti GSP specifiškumą, reikia naudoti atvirkštinę transkriptazę su dideliu terminiu stabilumu.Karščiui stabili atvirkštinė transkriptazė gali būti izoliuota aukštesnėje temperatūroje, kad padidėtų reakcijos intensyvumas.Pavyzdžiui, jei GSP yra atkaitintas 55 ° C temperatūroje, GSP specifiškumas nėra visiškai išnaudojamas, jei atvirkštinė transkripcija atliekama 37 ° C temperatūroje su mažu griežtumu, naudojant AMV arba M-MLV.Tačiau SuperScripⅡ ir ThermoScript gali reaguoti esant 50 ℃ ar aukštesnei temperatūrai, o tai pašalina nespecifinius produktus, pagamintus žemesnėje temperatūroje.Siekiant maksimalaus specifiškumo, RNR ir pradmenų mišinys gali būti tiesiogiai perkeltas iš 65 ℃ denatūravimo temperatūros į atvirkštinės transkripcijos palaikymo temperatūrą, pridedant 2 kartus pašildyto reakcijos mišinio (terminis cDNR sintezės inicijavimas).Tai padeda išvengti bazių poravimosi tarp molekulių žemoje temperatūroje.Naudojant PGR instrumentą, supaprastėja daugybė temperatūros perėjimų, reikalingų RT-PGR.
3. Sumažinkite genomo DNR užteršimą:
Vienas iš galimų RT-PGR sunkumų yra tas, kad RNR užteršia genominę DNR.Naudojant geresnius RNR atskyrimo metodus, tokius kaip Trizol Reagent, sumažėja genomo DNR užterštumas RNR preparatuose.Siekiant išvengti produktų, pagamintų iš genominės DNR, RNR gali būti apdorota amplifikacijos laipsnio DnasⅠ, kad būtų pašalinta užteršta DNR prieš atvirkštinę transkripciją.Mėginiai buvo laikomi 65 ℃ temperatūroje 2,0 mM EDTA 10 minučių, kad būtų nutrauktas DNazėsⅠ virškinimas.EDTA sudaro magnio jonus, kad būtų išvengta nuo magnio jonų priklausančios RNR hidrolizės, kuri vyksta aukštoje temperatūroje.
Norint atskirti amplifikuotą cDNR nuo genomo DNR amplifikacijos produkto, gali būti sukurti pradmenys, kurie atskirai susijungia su atskirtu egzonu.PGR produktai, gauti iš cDNR, bus trumpesni nei tie, gauti iš užterštos genominės DNR.Kontroliuojamas eksperimentas be atvirkštinės transkripcijos taip pat atliekamas su kiekvienu RNR šablonu, siekiant nustatyti, ar tam tikras fragmentas yra iš genominės DNR ar cDNR.PGR produktai, gauti nesant atvirkštinės transkripcijos, yra gauti iš genomo.
Susijęs produktas
RT-PCR lengvasᵀᴹAš (vienas žingsnis)
- Vieno žingsnio rinkinys leidžia atlikti atvirkštinę transkripciją ir PGR tame pačiame mėgintuvėlyje.Tereikia pridėti šabloninę RNR, specifinius PGR pradmenis ir ddH be RNazės2O.
- Greitai ir tiksliai galima atlikti kiekybinę RNR analizę realiuoju laiku.
- Rinkinyje naudojamas unikalus Foregene atvirkštinės transkripcijos reagentas ir Foregene HotStar Taq DNR polimerazė kartu su unikalia reakcijos sistema, siekiant efektyviai pagerinti amplifikacijos efektyvumą ir reakcijos specifiškumą.
- Optimizuotos reakcijos sistemos dėka reakcija turi didesnį aptikimo jautrumą, stipresnį terminį stabilumą ir geresnę toleranciją.
- Veiksmingas gebėjimas pašalinti gDNR, kuri gali pašalinti gDNR iš šablono per 2 minutes.
- Veiksminga atvirkštinės transkripcijos sistema, pirmosios krypties cDNR sintezė užtrunka tik 15 minučių.
-Sudėtingi šablonai: šablonus su dideliu GC turiniu ir sudėtinga antrine struktūra taip pat galima pakeisti labai efektyviai.
- Didelio jautrumo atvirkštinės transkripcijos sistema, pg lygio šablonai taip pat gali gauti aukštos kokybės cDNR.
- Atvirkštinės transkripcijos sistema turi aukštą šiluminį stabilumą, optimali reakcijos temperatūra yra 42 ℃, ir ji vis dar turi gerą atvirkštinės transkripcijos našumą esant 50 ℃.
Paskelbimo laikas: 2023-07-07
