1. Pagrindinės žinios (jei norite pamatyti eksperimentinę dalį, perkelkite tiesiai į antrąją dalį)
Kaip įprastos PGR išvestinė reakcija, realaus laiko PGR daugiausia stebi amplifikacijos produkto kiekio pasikeitimą kiekviename PGR amplifikacijos reakcijos cikle realiu laiku, keičiantis fluorescencijos signalui, ir kiekybiškai analizuoja pradinį šabloną per santykį tarp ct vertės ir standartinės kreivės.
Specifiniai RT-PGR duomenys yrapradinė linija, fluorescencijos slenkstisirCt vertė.
| bazinė linija: | 3-15 ciklo fluorescencijos reikšmė yra bazinė (bazinė), kurią sukelia retkarčiais pasitaikanti matavimo paklaida. |
| Slenkstis (slenkstis): | Nurodo fluorescencijos aptikimo ribą, nustatytą atitinkamoje amplifikacijos kreivės eksponentinės augimo srities vietoje, paprastai 10 kartų didesnę už bazinės linijos standartinį nuokrypį. |
| CT vertė: | Tai PGR ciklų skaičius, kai fluorescencijos vertė kiekviename reakcijos mėgintuvėlyje pasiekia slenkstį. Ct reikšmė yra atvirkščiai proporcinga pradinio šablono kiekiui. |
Įprasti RT-PGR žymėjimo metodai:
| metodas | pranašumas | trūkumas | taikymo sritis |
| SYBR žaliaⅠ | Platus pritaikymas, jautrus, pigus ir patogus | Grunto reikalavimai dideli, linkę į nespecifines juostas | Jis tinka įvairių tikslinių genų kiekybinei analizei, genų ekspresijos tyrimams, transgeninių rekombinantinių gyvūnų ir augalų tyrimams. |
| TaqMan | Geras specifiškumas ir didelis pakartojamumas | Kaina didelė ir tinka tik konkretiems tikslams. | Patogenų nustatymas, atsparumo vaistams genų tyrimai, vaistų veiksmingumo vertinimas, genetinių ligų diagnostika. |
| molekulinis švyturys | Didelis specifiškumas, fluorescencija, žemas fonas | Kaina didelė, tinka tik konkrečiam tikslui, dizainas sudėtingas, o kaina didelė. | Specifinė genų analizė, SNP analizė |
2. Eksperimentiniai žingsniai
2.1. Apie eksperimentinį grupavimą- grupėje turi būti keli šuliniai ir turi būti biologiniai pasikartojimai.
| ① | Tuščias valdymas | Naudojamas ląstelių augimo būsenai eksperimentuose nustatyti |
| ② | Neigiama kontrolinė siRNR (nespecifinė siRNR seka) | Parodykite RNAi veikimo specifiškumą.siRNR gali sukelti nespecifinį streso atsaką, kai koncentracija yra 200 nM. |
| ③ | Transfekcijos reagento kontrolė | Neįtraukite transfekcijos reagento toksiškumo ląstelėms arba poveikio tikslinio geno ekspresijai |
| ④ | siRNR prieš tikslinį geną | Sumažinkite tikslinio geno ekspresiją |
| ⑤ (neprivaloma) | teigiama siRNR | Naudojamas eksperimentinės sistemos ir veikimo problemoms šalinti |
| ⑥ (neprivaloma) | Fluorescencinės kontrolės siRNR | Ląstelių transfekcijos efektyvumą galima stebėti mikroskopu |
2.2 Grunto projektavimo principai
| Padidintas fragmento dydis | Pageidautina 100-150 bp |
| Grunto ilgis | 18-25 bp |
| GC turinys | 30-70%, geriausia 45-55% |
| Tm vertė | 58-60 ℃ |
| Seka | Venkite nuolatinio T/C;A/G nuolatinis |
| 3 pabaigos seka | Venkite GC turtingo arba AT turtingo;galinė bazė pageidautina yra G arba C;geriausia vengti T |
| Komplementarumas | Venkite papildomų sekų, sudarytų iš daugiau nei 3 bazių pradmenyje arba tarp dviejų pradmenų |
| Specifiškumas | Norėdami patvirtinti pradmenų specifiškumą, naudokite greitąją paiešką |
①SiRNR yra specifinė rūšiai, o skirtingų rūšių sekos bus skirtingos.
②SiRNR yra supakuota į liofilizuotus miltelius, kurie gali būti stabiliai laikomi 2-4 savaites kambario temperatūroje.
2.3 Įrankiai arba reagentai, kuriuos reikia paruošti iš anksto
| Gruntas (vidinė nuoroda) | Įskaitant du pirmyn ir atgal |
| Pradmenys (tikslinis genas) | Įskaitant du pirmyn ir atgal |
| Tikslinė Si RNR (3 juostelės) | Paprastai įmonė susintetins 3 juosteles ir RT-PGR pasirinks vieną iš trijų. |
| Transfekcijos rinkinys | Lipo2000 ir kt. |
| RNR greito ištraukimo rinkinys | RNR ekstrahavimui po transfekcijos |
| Greitos atvirkštinės transkripcijos rinkinys | cDNR sintezei |
| PCR amplifikacijos rinkinys | 2×Super SYBR žalia qPCR pagrindinis mišinys |
2.4 Dėl problemų, į kurias reikia atkreipti dėmesį atliekant konkrečius eksperimentinius veiksmus:
①siRNR transfekcijos procesas
1. Dengimui galite pasirinkti 24 šulinėlių plokštelę, 12 šulinėlių plokštelę arba 6 šulinėlių plokštelę (vidutinė 24 šulinėlių plokštelės duobutėje siūloma RNR koncentracija yra apie 100-300 ng/uL), o optimalus ląstelių transfekcijos tankis yra iki 60–80 %.
2. Transfekcijos etapai ir specifiniai reikalavimai griežtai atitinka instrukcijas.
3. Po transfekcijos mėginius galima paimti per 24–72 valandas, kad būtų galima aptikti mRNR (RT-PGR) arba baltymą aptikti per 48–96 valandas (WB).
② RNR ekstrahavimo procesas
1. Užkirsti kelią užteršimui egzogeniniais fermentais.Tai daugiausia apima griežtą kaukių ir pirštinių dėvėjimą;naudojant sterilizuotus pipetės antgalius ir EP vamzdelius;eksperimente naudojamas vanduo turi būti be RNazių.
2. Rekomenduojama daryti du kartus, kaip siūloma greito ištraukimo rinkinyje, tai tikrai pagerins grynumą ir išeigą.
3. Atliekų skystis neturi liesti RNR kolonėlės.
③ RNR kiekybinis nustatymas
Išskyrus RNR, ją galima nustatyti tiesiogiai naudojant Nanodrop, o minimalus rodmuo gali būti net 10 ng/ul.
④ Atvirkštinio transkripcijos procesas
1. Dėl didelio RT-qPCR jautrumo kiekvienam mėginiui reikia padaryti bent 3 lygiagrečius šulinukus, kad vėliau Ct nebūtų per daug skirtinga arba SD nebūtų per didelis statistinei analizei.
2. Neužšaldykite ir neatšildykite Master mix pakartotinai.
3. Kiekvieną vamzdelį/angą reikia pakeisti nauju antgaliu!Nenaudokite to paties pipetės antgalio nuolat mėginiams pridėti!
4. Įdėjus mėginį prie 96 šulinėlių plokštelės pritvirtintą plėvelę reikia išlyginti plokštele.Prieš dedant ant aparato geriausia centrifuguoti, kad ant vamzdelio sienelės esantis skystis galėtų tekėti žemyn ir pašalinti oro burbuliukus.
⑤ Bendroji kreivės analizė
| Nėra logaritminio augimo laikotarpio | Galbūt didelė šablono koncentracija |
| Nėra CT vertės | Neteisingi fluorescencinių signalų aptikimo veiksmai; pradmenų ar zondų degradacija – jo vientisumą galima nustatyti PAGE elektroforezės būdu; nepakankamas šablono kiekis; šablonų degradacija – ruošiant mėginį išvengiama priemaišų patekimo ir pakartotinio užšaldymo bei atšildymo; |
| Ct>38 | Žemas stiprinimo efektyvumas;PGR produktas per ilgas;suyra įvairūs reakcijos komponentai |
| Linijinė stiprinimo kreivė | Zondai gali būti iš dalies sugadinti dėl pasikartojančių užšaldymo ir atšildymo ciklų arba ilgalaikio šviesos poveikio |
| Dvigubų skylių skirtumas yra ypač didelis | Reakcijos tirpalas nėra visiškai ištirpęs arba reakcijos tirpalas nėra sumaišytas;PGR prietaiso terminė vonia užteršta fluorescencinėmis medžiagomis |
2.5 Apie duomenų analizę
qPCR duomenų analizę galima suskirstyti į santykinį ir absoliutųjį kiekybinį įvertinimą.Pavyzdžiui, gydymo grupės ląstelės, palyginti su kontrolinės grupės ląstelėmis,
Kiek kartų pasikeičia X geno mRNR, tai yra santykinis kiekybinis įvertinimas;tam tikrame ląstelių skaičiuje – X geno mRNR
Kiek kopijų yra, tai yra absoliutus kiekybinis įvertinimas.Dažniausiai laboratorijoje naudojame santykinį kiekybinį metodą.Paprastai,2-ΔΔct metodasyra dažniausiai naudojamas eksperimentuose , todėl čia bus išsamiai pristatytas tik šis metodas.
2-ΔΔct metodas: gautas rezultatas yra tiriamosios grupės tikslinio geno ekspresijos skirtumas, palyginti su tikslinio geno kontrolinėje grupėje.Reikalaujama, kad tiek tikslinio geno, tiek vidinio etaloninio geno amplifikacijos efektyvumas būtų artimas 100%, o santykinis nuokrypis neviršytų 5%.
Skaičiavimo metodas yra toks:
Δct kontrolinė grupė = tikslinio geno ct reikšmė kontrolinėje grupėje – vidinio etaloninio geno ct reikšmė kontrolinėje grupėje
Δct eksperimentinė grupė = tikslinio geno ct vertė eksperimentinėje grupėje – vidinio etaloninio geno ct reikšmė eksperimentinėje grupėje
ΔΔct=Δct eksperimentinė grupė-Δct kontrolinė grupė
Galiausiai apskaičiuokite išraiškos lygio skirtumo kartotinį:
Keisti Fold=2-ΔΔct (atitinka „Excel“ funkciją yra POWER)
Susiję produktai:
Paskelbimo laikas: 2023-05-20
