Patarimai, kaip pagerinti klijų regeneraciją

1. Elektroforezės metu padidinkite mėginio apkrovą.

2. Naudokite šviežiai paruoštą elektroforezės buferį.

3. Pjaudami klijus stenkitės pjaustyti tik klijus juostelėmis, kad sumažintumėte klijų pjovimo apimtį: nereikia klijų su mažais paskirties fragmentais, kitaip tai turės įtakos regeneravimo greičiui.

4. Išlydę du ar daugiau klijų gabalėlių, naudokite vamzdelį, nesvarbu, kokio tūrio būtų, ir perkelkite į tą pačią kolonėlę.

5. Į zolį įpilamo tirpalo gali būti šiek tiek daugiau, o tai yra palankesnė DNR prisijungimui prie membranos, bet paprastai neviršija 750 ul.

6. Gelio atgavimo raktas yra prijungti DNR prie kolonėlės per kolonėlėje esančio tirpalo druskos koncentraciją, rūgštingumą (įkrovą) ir hidrofobiškumą.Todėl, jei elektroforezės buferio pH yra per aukštas, į zolį galima įpilti 10ul (pH 5,0, 3mol/L NaAC);siekiant geriau sulaikyti DNR molekules ant membranos, ištirpinus klijus, į skystį galima įpilti 30 % izopropanolio, kad jis įkaistų.

7. Prieš pridėdami eliuentą, palikite kolonėlę kambario temperatūroje kelioms minutėms (apie 10 minučių), kad etanolis visiškai išgaruotų.

8. Galiausiai įpilkite mažiau eliuento, kad sumažintumėte regeneravimo tūrį.Paprastai eliuavimui naudojamas 30-50μl eliuentas (ne per mažai, kitaip jis negalės sudrėkinti membranos, o tai nėra palanki eliuavimui);eliuavimo lašeliai yra membranos centre, kad visiškai išplautų su membrana surištą DNR.

9. Įpylus eliuento galima eliuuoti 55 laipsnių vandens vonioje 5 minutes arba dėti į 50 laipsnių vandens vonią ilgiau nei 10 minučių arba užsandarinti parafilme 4 laipsnių temperatūroje per naktį, o paskui centrifuguoti, kad atsigautų kitą dieną, efektas geras.

10. Supilkite centrifuguotą eliuatą atgal į adsorbcijos kolonėlę ir vėl centrifuguokite.

Išsamūs PGR produkto atgavimo metodai ir procedūros

1. Įprastas gumos perdirbimas

Jei norite susigrąžinti klijus, geriausia naudoti rinkinį, kuris yra patogus ir turi šiek tiek didesnį atsistatymo greitį.Jei jums tikrai reikia jį atkurti rankiniu būdu, nupjovę klijus galite pridėti 3 kartus didesnį TE tūrį.Išlydžius vandens vonioje, fenolis, fenolis/chloroformas švariai ekstrahuojami ir nusodinamas etanolis.Viskas.

2. DNR išgavimas iš žemos lydymosi temperatūros gelių

DNR fragmentų gryninimas Įpilkite TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA), lygų gelio tūriui, ir padėkite į 65°C vandens vonią 5 minutėms, kad gelis visiškai ištirptų.

Kai jis buvo atšildytas iki kambario temperatūros, buvo pridėtas vienodas kiekis fenolio (prisotintas TE, TE buvo užsandarintas viršutiniame sluoksnyje, o apatinis fenolio sluoksnis pašalintas), mišinys švelniai sumaišomas (maišyti nereikia) ir centrifuguojamas 12 000 aps./min 3 minutes.Pakartokite 1-2 kartus.

Paimkite supernatantą, įpilkite 0,1 tūrio 3 mol/l natrio acetato (pH 5,2) ir 2,5 karto daugiau absoliutaus etanolio, kad nusodintumėte etanoliu.Išgrynintą DNR ištirpinkite atitinkamu TE kiekiu, išmatuokite turinį ir paruoškite naudojimui (galima naudoti tikslinių genų struktūros analizei, zondo paruošimui ir pan.).

3. PGR atkūrimas su geru amplifikacijos specifiškumu

Jei PGR amplifikacijos specifiškumas yra geras, tai tik paprastas PGR produkto išgryninimas ir atkūrimas.Galite pridėti 50 ug/ml proteinazės K į PGR produktą, 37 laipsnių 1 val., vieną kartą ekstrahuoti fenoliu/chloroformu, vieną kartą ekstrahuoti chloroformu ir pridėti 0,1 tūrio supernatanto.Natrio acetatas buvo išgautas nusodinant 2,5 tūrio absoliutaus etanolio.

Susiję produktai:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/