Tradicinės atvirkštinės transkriptazės negali toleruoti aukštų temperatūrų (optimali temperatūra MMLV aktyvumui yra 37–50 °C, o AMV – 42–60 °C).Sudėtingesnė virusinė RNR negali būti veiksmingai atvirkštinė transkribuota į cDNR žemoje temperatūroje, todėl aptikimo efektyvumas sumažėja.Tradicinis RT-qPCR paprastai reikalauja dviejų pagrindinių fermentų (atvirkštinės transkriptazės ir DNR polimerazės), todėl neįmanoma supaprastinti reakcijos sistemos veikimo ir sumažinti sąnaudas.Čia pristatysime dvi aukštai temperatūrai atsparias atvirkštines transkriptazes – TtH ir RevTaq.Šie du fermentai taip pat atlieka DNR polimerazės funkciją, todėl jie vadinami bifunkciniais fermentais.

TtH DNR polimerazė

Jūs tikriausiai girdėjote apie TtH, kuris gaunamas iš termofilinės bakterijos Thermus thermophilus HB8.Esant dvivalečiams katijonams, tokiems kaip Mg2+, jis turi DNR polimerazės aktyvumą.Jis plačiai naudojamas PGR reakcijose, tokiose kaip Taq fermentas, tačiau turi didesnį atsparumą karščiui nei Taq fermentas, todėl jis taip pat geriau veikia PGR su dideliu GC kiekiu.

· Šis fermentas iš esmės neturi 3′→5′ egzonukleazės aktyvumo ir 5′→3′ egzonukleazės aktyvumo, todėl jį galima naudoti ir dideoksi sekvenavimui.

· Šis fermentas pasižymi RTazės aktyvumu.Esant Mn2+, RTazės aktyvumas sustiprės.Naudojant šią funkciją, jis gali būti naudojamas atvirkštinės transkripcijos reakcijai ir PGR reakcijai atlikti tame pačiame mėgintuvėlyje, tai yra, vienos pakopos RT-PGR.Tačiau esant Mn2+, RT-PGR tikslumas nėra didelis.RT aktyvumas neturi nieko bendra su rnaazės H aktyvumu.

· Padidėjęs Tth-DNR polimerazės aktyvumas (pH9, optimalus +55℃～+70℃, maksimalus +95℃) įveikia RNR antrinės struktūros sukeltas problemas.Gautą kDNR galima amplifikuoti PGR būdu su tuo pačiu fermentu, esant Mg2+ jonams.

· Dėl Tth-DNR polimerazės gebėjimo atlikti atvirkštinę transkripciją ir DNR amplifikaciją esant aukštai temperatūrai šis fermentas yra naudingas atliekant kiekybinę RT-PGR, klonavimą ir ląstelių bei virusinės RNR genų ekspresijos analizę.
· Tth-DNR polimerazė naudojama RT-PGR, siekiant amplifikuoti RNR iki 1 kb.

Savybės ir privalumai

T-DNR polimerazė:

• Užtikrinti optimizuotą polimerazės grandininės reakcijos (PGR) produkto dydį, bent 1000 bp RT-PGR reakcijoje

• Kaip substratą priimti modifikuotą dezoksiribonukleozido trifosfatą

• Nesusijęs su RNazės H aktyvumu

• Turi didelį šiluminį stabilumą, kad būtų galima įveikti problemas, dažniausiai susijusias su didele antrine RNR struktūra

RevTaq RT-PCR DNR polimerazė

Karščiui atspari DNR polimerazė, turinti atvirkštinės transkriptazės aktyvumą

RevTaq-RT-PCR-DNR polimerazė yra sukonstruotas, labai atsparus karščiui, dviejų funkcijų fermentas, turintis atvirkštinės transkriptazės ir DNR polimerazės aktyvumą, gautą nukreiptos ir dirbtinės evoliucijos būdu.

· RevTaq RT-PCR DNR polimerazės pusinės eliminacijos laikas 95°C temperatūroje yra ilgesnis nei 40 minučių.

· RevTaq RT-PCR DNR polimerazė leidžia aukštoje temperatūroje atlikti atvirkštinę transkripciją tiesiai iš RNR šablono, o atvirkštinės transkripcijos žingsnį galima pakartoti kelis kartus, kad būtų sukurta daugiau cDNR šablonų.

· RevTaq RT-PCR DNR polimerazė leidžia atlikti „nulinės pakopos“ RT-PGR (nėra izoterminės atvirkštinės transkripcijos pakopos), nes ciklinio PGR išplėtimo etape atvirkštinė transkripcija ir DNR amplifikacija vyksta vienu metu.Tai taip pat skatina atvirkštinės transkripcijos reakciją aukštoje temperatūroje, taip sumažinant problemas, su kuriomis susiduriama lydant stiprią antrinę RNR struktūrą aukštoje temperatūroje.

· Dėl aptamero pagrindu pagamintos karšto paleidimo formulės RevTaq RT-PCR DNR polimerazė duos geresnių rezultatų, kai atkaitinimo ir pratęsimo temperatūra yra aukštesnė nei 57°C.

· Kadangi fermentas yra atsparus karščiui, rekomenduojama projektuoti pradmenis ir zondus su labai aukšta lydymosi temperatūra (>60°C).

· Reakcijos nustatymo proceso metu rekomenduojama optimizuoti atkaitinimo/pratęsimo etapo temperatūrą taikant temperatūros gradientą.

· Kuo aukštesnė temperatūra, tuo didesnis PGR specifiškumas.Atvirkštinės transkripcijos ciklas paprastai atliekamas aukštesnėje temperatūroje nei PGR ciklas, nes hibridizacija DNR pradmuo:RNR šablonas paprastai turi aukštesnę lydymosi temperatūrą nei DNR pradmuo:cDNR šablono dupleksas.

· RevTaq RT-PCR DNR polimerazė yra genetiškai modifikuota ir optimizuota, o amplikono dydis yra 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNR polimerazės aptikimo riba pasiekia 4 kopijas/

Optimizuota reakcijos sistema (aukštos lydymosi temperatūros pradmenų nustatymas) parodyta paveikslėlyje.RevTaq RT-PCR DNR polimerazės valdomas RT-PGR jautrumas yra geresnis nei TaqPath 1 žingsnio RT-qPCR pagrindinis mišinys ir mažesnis aptikimo mėginio praskiedimo gradientas.

Daugiau privalumų:

Greito paleidimo funkcija → Pradinis terminis denatūravimo etapas gali būti praleistas.

Karštojo paleidimo aptamero formulė → Nedelsdami užtikrinkite 100% fermentų aktyvumą ir apsaugokite nuo nespecifinio amplifikacijos žemoje temperatūroje (<57°C).

Skilimo funkcija → RNR ekstrahavimo etapas praleistas, nes RevTaq RT-PCR DNR polimerazė taip pat gali apdoroti neapdorotus reakcijos mėginius.Jis gali nedelsiant sunaikinti eukariotų, bakterijų ir virusų ląstelių membranas karšto RT-PGR ciklo metu.

IVD žaliavos lygis → aukšti kokybės standartai ir itin konkurencingos kainos