RNazė yra jautrus žodis, kurio nenori girdėti daugelis studentų, kurie dažnai atlieka RNR ekstrahavimo eksperimentus.Visiškai ginkluota RNR, kuri galiausiai buvo ekstrahuota labai toksiškais reagentais fenoliu ir chloroformu, buvo suskaidyta.Aš nesu susitaikęs!!!Šiandien pažvelkime į garsiosios Rnase kilmę.

Ribonukleazė (RNazė) arba RNazė yra nukleazė, kuri gali hidrolizuoti RNR į mažas molekules.RNazė, kaip mažos molekulės baltymas, yra neįprastai stabili .Įprasta aukštos temperatūros ir aukšto slėgio garų sterilizacija ir baltymų inhibitoriai negali jo visiškai inaktyvuoti.RNazės stabilumą daugiausia lemia disulfidiniai ryšiai struktūroje.Pavyzdžiui, dažniausiai naudojama galvijų kasos RNazė turi tik 124 aminorūgštis, bet turi 4 disulfidines jungtis.Sieros jungtis ir disulfidinė jungtis suteikia RNazei puikų terminį stabilumą.Be to, rnazė turi palyginti mažą molekulinę masę ir daugeliu atvejų gali greitai atkurti pradinę konformaciją.

Be to, kad jis yra labai stabilus,Rnazės yra visur laboratorijoje .RNazė yra biologinės gynybos mechanizmas.Ląstelei egzogeninė RNR dažnai būna mirtina.Palyginti su egzogenine DNR, egzogeninė RNR dažnai yra pavojingesnė.RNR yra laimingai transkribuojama ir verčiama, todėl beveik visi organizmai sukūrė RNazes, kad apsisaugotų nuo egzogeninės RNR invazijos.Todėl laboratorijoje auginamos bakterinės ląstelės ir jūs, kurie ekstrahuojate RNR, skleidžia RNazės aromatą.Žmogaus kūno skysčiuose (seilėse, ašarose ir kt.) yra daug RNazės, todėl neverk, kai RNR suardoma.Kuo daugiau verksite, tuo blogiau degraduoja RNR!!Sesuo Daiyu netinka RNR ekstrakcijai!

Be to, jūsų gležnoje odoje taip pat yra daug RNazės, o odos paliestuose žymekliuose, pipetėse, šaldytuvo durelėse ir durų rankenose taip pat yra RNazės.

Kai tiek daug siautėjimo, pažiūrėkime, kaip elgtis su RNazėmis.

Pirmas dalykas, apie kurį visi galvoja pašalindami RNRDEPC(dietilo pirokarbonatas).DEPC daugiausia denatūruoja baltymą, susijungdamas su RNazės aktyvios grupės histidino imidazolo žiedu, taip slopindamas fermento aktyvumą.0,1% DEPC gali turėti geresnį Rnase šalinimo poveikį, tačiau turime atkreipti dėmesį, kad DEPC yra žinomas kancerogenas, todėl jį naudojant reikia atkreipti ypatingą dėmesį.

RNase atveju turime pradėti nuo dviejų aspektų,pirmasis – slopinti endogeninės RNazės aktyvumą

Įprasti RNR ekstrahavimo reagentai, tokie kaip guanidino izotiocianatas ir DTT, esantys Trizol, gali atidaryti RNazės disulfidinį ryšį, tačiau vis dar yra keletas RNazių, ypač audinių mėginiuose, todėl atkreipkite dėmesį į žemą temperatūrą.

1.Išėmę audinio mėginį iš karto panardinkite į skystą azotą arba į komercinį RNR konservavimo tirpalą.

2.Ištraukę ląstelės mėginio RNR, įpilkite ją į lizės tirpalą ir lizuokite ant ledo dėžutės

3. Malimui geriausia naudoti skystą azotą kai audinių mėginiai homogenizuojami.Naudodami elektrinį homogenizatorių be skysto azoto, atkreipkite dėmesį, kad homogenato adapteris būtų visiškai atvėsintas.

Antroji yra egzogeninė DNazė

1.Būkite visiškai apsiginklavę, dėvėkite laboratorinį chalatą, dėvėkite kaukę ir būtinai mūvėkite porą naujų pirštinių (nebūkite tokie taupūs!! Reikėtų pažymėti, kad Trizol yra labai ėsdinantis, be to, jis yra labai stiprus per pirštines, todėl nelašinkite ant rankų).

2.Visi panaudoti pipetės antgaliai, EP vamzdeliai, PGR mėgintuvėliai ir kita įranga turi būti apdoroti RNazėmis.Jį galima mirkyti 0,1% DEPC ir tada suspausti aukštu slėgiu.Atkreipkite dėmesį į darbą traukos gaubte.Vietiniai tironai gali tiesiogiai nusipirkti vartojimo reikmenis fermentams pašalinti.

PS: Leiskite man papasakoti apie tingų metodą.Nors aukšta temperatūra ir aukštas slėgis negali visiškai pašalinti RNazės, ji pašalins didelę jos dalį.2 kartus aukšta temperatūra ir aukštas slėgis turi gerą poveikį, o RNR išskyrimas turi mažai įtakos.

3.Alkoholis gali denatūruoti baltymus,todėl RNR ekstrahavimo lentelę galima nušluostyti 75% alkoholiu , o pirštines taip pat galima apipurkšti alkoholiu.

4.Galutinis RNR tirpinimo tirpalas ir centrifugos mėgintuvėlis taip pat turi būti apdoroti de-RNaze.DEPC vanduo yra dažniausiai naudojamas RNR tirpinamasis tirpalas.Pakalbėkime apie teisingą DEPC vandens paruošimo būdą (pirkdami nepamirškite perpakuoti komercinio DEPC)

Įpilkite DEPC į itin gryną vandenį santykiu 1:1000, gerai suplakite, palikite per naktį 37°C temperatūroje ir sterilizuokite 121°C aukštoje temperatūroje ir aukštu slėgiu 15 minučių.DEPC vanduo gali būti laikomas -20 °C temperatūroje 1 ml alikvotinėse dalyse.

Galiausiai, apibendrinant: svarbiausia yra žema temperatūra, eksploatacinės medžiagos yra gerai tvarkomos, pilnai ginkluotos ir mažiau kalbama!

Na, tai šiandienos strategija.Linkiu visos jūsų minėtos RNR koncentracijos ir grynumo.Abu A260 / A280 yra 2.0!!!

Žinoma, jei naudojate akambario temperatūros veikimo RNR ištraukimo rinkinys, galite nesusidurti su aukščiau nurodytomis problemomis.

Veikiant kambario temperatūroje, nepridedant DNazės, visa RNR iš ląstelių išskiriama per 11 minučių, o iš gyvūnų audinių ar augalų – per 30 minučių.

Dėl bandomųjų pavyzdžių kreipkitės:overseas@foregene.com

Susiję produktai:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/