qPCR eksperimentuose pradmenų dizainas taip pat yra labai svarbi grandis.Ar pradmenys tinkami, ar ne, glaudžiai susiję su tuo, ar amplifikacijos efektyvumas pasiekia standartą, ar amplifikuoti produktai yra specifiniai ir ar yra eksperimentinių rezultatų.
Taigi, kaip pagerinti qPCR pradmenų specifiškumą?Didelis stiprinimo efektyvumas?
Šiandien kartu suprojektuosime qPCR pradmenis ir leisime, kad qPCR pradmenų dizainas taptų veiksmingu eksperimentų įgūdžiu.
Kurdami qPCR pradmenis, dažniausiai atkreipkite dėmesį į šiuos dalykus: pradmenys turi būti projektuojami kiek įmanoma skersai intronų, gaminio ilgis turi būti 100-300 bp, Tm vertė turi būti kuo artimesnė 60°C, o prieš ir pasroviui esantys pradmenys turi būti kuo arčiau, o pradmenų pabaiga turi būti G arba C ir pan.
1. Pradmenų, apimančių intronus, projektavimas
Kuriant qPCR pradmenis, pasirenkant pradmenis, sukurtus tarp intronų, gDNR šablonas gali būti amplifikuojamas, o visi produktai yra gauti iš kDNR amplifikacijos, taip pašalinant gDNR užteršimo įtaką.
2. Grunto ilgis
Pradmenų ilgis paprastai yra nuo 18 iki 30 nt, o amplifikacijos produkto ilgis turėtų būti kiek įmanoma labiau kontroliuojamas nuo 100 iki 300 bp.
Jei gruntas yra per trumpas, jis sukels nespecifinį stiprinimą, o jei jis bus per ilgas, jis lengvai suformuos antrinę struktūrą (pvz., plaukų segtuko struktūrą).Jei amplifikacijos produktas yra per ilgas, jis netinkamas polimerazės reakcijai, o tai turės įtakos PGR amplifikacijos efektyvumui.
3. GC kiekis ir Tm reikšmė
GC kiekis gruntuose turi būti kontroliuojamas nuo 40 % iki 60 %.Jei jis yra per didelis arba per mažas, tai nėra palanki reakcijai pradėti.Norint gauti tą pačią Tm vertę ir atkaitinimo temperatūrą, tiesioginio ir atvirkštinio pradmenų GC kiekis turi būti beveik toks pat.
Tm vertė turi būti kiek įmanoma tarp 55–65 °C, paprastai apie 60 °C, o prieš srovę ir pasroviui Tm vertė turi būti kuo artimesnė, pageidautina ne didesnė kaip 4 °C.
4. Venkite pasirinkti A 3′ grunto gale
Kai 3′ pradmens galas nesutampa, skirtingų bazių sintezės efektyvumas labai skiriasi.Kai paskutinė bazė yra A, ji taip pat gali inicijuoti grandinės sintezę net ir nesutapimo atveju, o kai paskutinė bazė yra T Kai , neatitikimo indukcijos efektyvumas labai sumažėja.Todėl stenkitės nesirinkti A 3′ grunto gale, o geriau rinktis T.
Jei tai yra zondo pradmenys, 5′ zondo galas negali būti G, nes net kai viena G bazė yra prijungta prie FAM fluorescencinių reporterių grupės, G taip pat gali užgesinti FAM grupės skleidžiamą fluorescencinį signalą, todėl gaunami klaidingai neigiami rezultatai.Pasirodyti.
5. Bazinis paskirstymas
Keturių bazių pasiskirstymas pradmenyje pageidautina atsitiktinis, vengiant daugiau nei 3 iš eilės G arba C 3′ gale ir daugiau nei 3 iš eilės.G arba C lengva sukurti porą GC turtingoje sekos srityje.
6. Grunto projektavimo sritis turėtų vengti sudėtingų antrinių struktūrų.
Antrinė struktūra, kurią sudaro viena amplifikacijos produkto grandinė, turės įtakos sklandžiam PGR eigai.Iš anksto numatydami, ar tikslinėje sekoje yra antrinės struktūros, stenkitės vengti šios srities kurdami pradmenis.
7. Patys gruntai ir tarp pradmenų turėtų stengtis išvengti nuoseklių vienas kitą papildančių bazių.
Negali būti nuoseklaus 4 bazių komplementarumo tarp paties grunto ir grunto.Pačiame grunte neturėtų būti papildomos sekos, kitaip jis susilankstys, sudarydamas plaukų segtuko struktūrą, o tai paveiks grunto ir šablono atkaitinimo derinį.
Tarp prieš srovę ir pasroviui esančių pradmenų negali egzistuoti papildomos sekos.Pradmenų papildymas sukurs pradmenų dimerus, kurie sumažins PGR efektyvumą ir netgi paveiks kiekybinį tikslumą.Jei grunto-dimerio ir plaukų segtuko struktūros yra neišvengiamos, △G reikšmė neturi būti per didelė (turėtų būti mažesnė nei 4,5 kcal/mol).
8. Pradmenys sustiprina tikslinį konkretų produktą.
Galutinis qPCR aptikimo tikslas yra suprasti tikslinio geno gausą.Jei įvyksta nespecifinis stiprinimas, kiekybinis įvertinimas bus netikslus.Todėl suprojektavus pradmenis, juos reikia išbandyti BLAST, o produktų specifiškumas lyginamas sekų duomenų bazėje.
Toliau imame žmogaus GAS6 (augimo sustabdymo specifinio 6) geną kaip pavyzdį kuriant qPCR pradmenis.
01 užklausos genas
Homo GAS6per NCBI.Čia turėtume atkreipti dėmesį į genų pavadinimo ir rūšių palyginimą, kad įsitikintume, jog jie yra nuoseklūs.
02 Raskite genų seką
(1) Jei tikslinė seka yra genominė DNR, pasirinkite pirmąją, kuri yra geno genominė DNR seka.
(2) Jei tikslinė seka yra mRNR, pasirinkite antrąją.Įvedę žemiau esančioje lentelėje spustelėkite „CDS“.Rudos fono seka yra koduojanti geno seka.
03 Dizaino gruntai
Įveskite „Primer-BLAST“ sąsają
Viršutiniame kairiajame kampe įveskite geno sekos numerį arba seką Fasta formatu ir užpildykite atitinkamus parametrus.

Spustelėkite „Gauti pradmenis“ ir pasirodys NCBI, kad praneštų, kad toks parametrų pasirinkimas bus sustiprintas kitiems sujungimo variantams.Galime patikrinti skirtingus sujungimo variantus ir pateikti juos, kad gautume atitinkamą pradmenų porą (kaip parodyta paveikslėlyje toliau).Šis procesas gali užtrukti keliasdešimt sekundžių.
Šių gruntų porų atkaitinimo temperatūra yra apie 60 °C.Pagal eksperimento tikslą eksperimentui rinkitės vidutinio ilgio, gero specifiškumo ir mažiau savaiminio pradmenų papildymo pradmenis, o sėkmės rodiklis yra gana didelis!
04 Pradmenų specifiškumo patikrinimas
Iš tikrųjų, be gruntų projektavimo, Primer-Blast gali įvertinti ir mūsų pačių sukurtus gruntus.Grįžkite į grunto dizaino puslapį, įveskite mūsų sukurtus gruntus prieš srovę ir pasroviui ir kiti parametrai nebus koreguojami.Pateikę galite pamatyti, ar pradmenų pora egzistuoja ir kituose genuose.Jei visi jie rodomi geno, kurį norime sustiprinti, tai reiškia, kad šios pradmenų poros specifiškumas yra puikus!(Pavyzdžiui, tai yra vienintelis pradinės užklausos rezultatas!)

05 Primer kokybės sprendimas
Koks gruntas yra „puikus“ gruntas, kuriame derinamas „stiprinimo efektyvumas iki standarto“, „pastiprintos produkto charakteristikos“ ir „patikimi eksperimentiniai rezultatai“?
Stiprinimo efektyvumas

lydymosi kreivė
Pradmenų amplifikacijos efektyvumas siekia 90% -110%, o tai reiškia, kad amplifikacijos efektyvumas yra geras, o lydymosi kreivė turi vieną smailę ir paprastai Tm> 80 ° C, o tai reiškia, kad amplifikacijos specifiškumas yra geras.
 
Susiję produktai:
Realaus laiko PCR Easy – SYBR GREEN I
Realaus laiko PCR Easy-Taqman