Grunto projektavimo pagrindas (galima išspręsti 99% problemų)
1. Pradmenų ilgis: Vadovėliui reikia 15-30 bp, paprastai apie 20 bp.Reali būklė geriau būtų 18-24bp, kad būtų užtikrintas specifiškumas, bet kuo ilgiau, tuo geriau, per ilgas gruntas taip pat sumažins specifiškumą ir sumažins derlių.
2. Pradmenų amplifikacijos intervalas: tinkamas 200–500 bp, o fragmentas gali būti išplėstas iki 10 kb tam tikromis sąlygomis.
3. Grunto bazė: G+C kiekis turi būti 40-60%, per mažas G+C stiprinimo efektas nėra geras, per daug G+C lengvai atsiranda nespecifinių juostų.ATGC geriausiai paskirstomas atsitiktinai, vengiant daugiau nei 5 purino arba pirimidino nukleotidų grupių.Multi-gc 5′ gale ir tarpinės sekos, kad padidintumėte stabilumą, venkite turtingo GC 3′ gale, be GC paskutinėms 3 bazėms arba be GC 3 iš paskutinių 5 bazių.
4. Venkite antrinės struktūros pradmenyse ir venkite komplementacijos tarp dviejų pradmenų, ypač komplementacijos 3' gale, kitaip susidarys pradmenų dimeris ir bus sukurtos nespecifinės amplifikuotos juostos.
5. Bazės 3' pradmenų gale, ypač paskutinės ir priešpaskutinės bazės, turi būti griežtai suporuotos, kad būtų išvengta PGR gedimo dėl nesuporuotų galinių bazių.
6. Pradmenys turi arba gali būti pridedami su atitinkamomis skilimo vietomis, o amplifikuota tikslinė seka turėtų turėti atitinkamas skilimo vietas, o tai labai naudinga skilimo analizei arba molekuliniam klonavimui.
7. Pradmenų specifiškumas: pradmenys neturėtų turėti akivaizdžios homologijos su kitomis nukleorūgščių sekų duomenų bazės sekomis.
8. Išmokite naudotis programine įranga: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (šis internetinis dizainas veikia geriausiai).
Aukščiau pateiktas turinys gali išspręsti mažiausiai 99% grunto projektavimo problemų.
Valdykite grunto dizaino detales
1. Grunto ilgis
Bendras grunto ilgis yra 18–30 bazių.Apskritai, svarbiausias veiksnys, lemiantis grunto atkaitinimo temperatūrą, yra grunto ilgis.Paprastai pasirenkama grunto atkaitinimo temperatūra (Tm vertė -5 ℃), o kai kurie tiesiogiai naudoja Tm vertę.Apytiksliai gruntų atkaitinimo temperatūrai apskaičiuoti galima naudoti šias formules.
Kai pradmenų ilgis yra mažesnis nei 20 bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5 ℃
Kai grunto ilgis didesnis nei 20 bp: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (%GC) -500 / ilgis -5 ℃
Be to, atkaitinimo temperatūrai apskaičiuoti taip pat galima naudoti daugybę programinės įrangos, skaičiavimo principas skirsis, todėl kartais skaičiuojama vertė gali turėti nedidelį tarpą.Siekiant optimizuoti PGR reakcijas, siekiant geriausio efektyvumo ir specifiškumo, naudojami trumpiausi pradmenys, užtikrinantys ne žemesnę nei 54 ℃ atkaitinimo temperatūrą.
Apskritai pradmenų specifiškumas padidėja keturis kartus kiekvienam papildomam nukleotidui, todėl mažiausias pradmenų ilgis daugeliui programų yra 18 nukleotidų.Viršutinė pradmenų ilgio riba nėra labai svarbi, daugiausia susijusi su reakcijos efektyvumu.Dėl entropijos kuo ilgesnis pradmuo, tuo mažesnis greitis, kuriuo jis susijungia, kad prisijungtų prie tikslinės DNR, kad susidarytų stabilus dvigrandinis šablonas, skirtas DNR polimerazei prisijungti.
Naudojant programinę įrangą pradmenų projektavimui, pradmenų ilgis gali būti nustatomas pagal TM reikšmę, ypač fluorescencinio kiekybinio PGR pradmenų atveju, TM = 60 ℃ ar pan.
2.GC turinys
Paprastai G+C kiekis pradmenų sekose yra 40% ~ 60%, o pradmenų poros GC kiekis ir Tm reikšmė turi būti suderinti.Jei gruntas turi rimtą polinkį į GC arba AT, atitinkamą kiekį A, T arba G ir C uodegos galima pridėti prie 5' pradmens galo.
3. Atkaitinimo temperatūra
Atkaitinimo temperatūra turi būti 5 ℃ žemesnė nei grandinės atjungimo temperatūra.Jei pradmenų bazių skaičius yra mažas, atkaitinimo temperatūrą galima atitinkamai padidinti, o tai gali padidinti PGR specifiškumą.Jei bazių skaičius yra didelis, atkaitinimo temperatūrą galima atitinkamai sumažinti.Atkaitinimo temperatūrų skirtumas tarp pradmenų poros 4 ℃ ~ 6 ℃ neturės įtakos PGR išeigai, tačiau idealiu atveju pradmenų poros atkaitinimo temperatūra yra tokia pati, kuri gali svyruoti tarp 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Venkite stiprinimo šablono antrinės struktūros srities
Renkantis sustiprintą fragmentą, geriausia vengti šablono antrinės struktūros srities.Stabilią antrinę tikslinio fragmento struktūrą galima numatyti ir įvertinti atitinkama kompiuterine programine įranga, kuri yra naudinga renkantis šabloną.Eksperimentiniai rezultatai rodo, kad plėtimasis dažnai būna nesėkmingas, kai plečiamo regiono laisvoji energija (△G) yra mažesnė nei 58,6 lkJ/mol.
5. Neatitikimas su tiksline DNR
Kai amplifikuota tikslinės DNR seka yra didelė, pradmenys gali prisijungti prie kelių tikslinės DNR dalių, todėl rezultate atsiranda kelios juostos.Šį kartą būtina naudoti BLAST programinės įrangos testavimą, svetainę:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Pasirinkite Lygiuoti dvi sekas (bl2seq).
Pradmenų sekos įklijavimas į 1 zoną ir tikslinės DNR sekos į 2 zoną yra keičiamos, o BLAST apskaičiuoja komplementariąsias, antisensines ir kitas galimybes, todėl vartotojams nereikia pastebėti, ar abi grandinės yra jutimo grandinės.Taip pat galite įvesti GI numerį, jei duomenų bazėje žinote sekos GI numerį, todėl jums nereikės įklijuoti didelės sekos dalies.Galiausiai spustelėkite Lygiuoti ties 3, kad pamatytumėte, ar pradmenys turi kelias homologines vietas tikslinėje DNR.
6. Grunto gnybtas
Pradedamojo 3 ' galas yra ta vieta, kur prasideda išplėtimas, todėl svarbu, kad ten neprasidėtų neatitikimai.3' galas neturėtų būti daugiau nei 3 iš eilės G arba C, nes dėl to pradmenys bus klaidingai suaktyvinti G+C sodrinimo sekos srityje.3' galas negali sudaryti jokios antrinės struktūros, išskyrus specialias PGR (AS-PCR) reakcijas, pradmens 3' galas negali būti nesutapęs.Pavyzdžiui, jei kodavimo sritis yra sustiprinta, pradmens 3' galas neturėtų būti baigtas trečioje kodono padėtyje, nes trečioji kodono padėtis yra linkusi išsigimti, o tai turės įtakos amplifikacijos specifiškumui ir efektyvumui.Naudodami aneksijos pradmenis, vadovaukitės kodono naudojimo lentele, atkreipkite dėmesį į biologinę pirmenybę, nenaudokite aneksijos pradmenų 3′ gale ir naudokite didesnę pradmenų koncentraciją (1 uM-3 uM).
7. Antrinė pradmenų struktūra
Patys pradmenys neturėtų turėti papildomų sekų, kitaip patys pradmenys susilankstys į plaukų segtukų struktūras, o ši antrinė struktūra turės įtakos pradmenų ir šablonų surišimui dėl sterinių kliūčių.Jei naudojamas dirbtinis sprendimas, pačių pradmenų ištisinės papildomos bazės neturėtų būti didesnės nei 3 bp.Tarp dviejų pradmenų neturėtų būti papildomumo, ypač reikėtų vengti 3' galo papildomo persidengimo, kad nesusidarytų pradmenų dimerai.Paprastai tarp pradmenų poros turi būti ne daugiau kaip 4 iš eilės bazių homologija arba komplementarumas.
8. Pridėkite žymeklius arba lokusus
5' galas turi mažai įtakos amplifikacijos specifiškumui, todėl gali būti modifikuojamas nepažeidžiant amplifikacijos specifiškumo.Pradmenų 5 galo modifikacija apėmė: fermento restrikcijos vietos pridėjimą;Pažymėtas biotinas, fluorescencija, digoksinas, Eu3+ ir kt. Įvesti baltymus rišančias DNR sekas;Mutacijų vietų įvedimas, mutacijų sekų įterpimas ir trūkstamas bei promotoriaus sekų įvedimas ir tt Papildomos bazės daugiau ar mažiau paveiks amplifikacijos efektyvumą ir padidins pradmenų dimero susidarymo tikimybę, tačiau kitam žingsniui reikia padaryti tam tikrų nuolaidų.Papildomos sekos, kurių nėra tikslinėje sekoje, pvz., restrikcijos vietos ir promotoriaus sekos, gali būti pridėtos prie pradmens 5′ galo, nepažeidžiant specifiškumo.Šios sekos neįtrauktos į pradmenų Tm verčių skaičiavimą, tačiau turėtų būti patikrintos dėl komplementarumo ir vidinės antrinės struktūros.
9. Subklonai
Dažniausiai PGR yra tik preliminarus klonavimas, o tada turime subklonuoti tikslinį fragmentą į įvairius vektorius, todėl turime sukurti papildomų bazių kitai operacijai PGR etape.
Kai kurios sekos, skirtos subklonavimui, yra apibendrintos žemiau.
Pridėta restrikcijos endonukleazės restrikcijos vieta
Fermentų restrikcijos vietų pridėjimas yra dažniausiai naudojamas PGR produktų subklonavimo metodas.Paprastai skilimo vieta yra šešios bazės, be 5 'skilimo vietos galo, reikia pridėti 2–3 apsaugines bazes.Tačiau apsauginių bazių, reikalingų skirtingiems fermentams, skaičius yra skirtingas.Pavyzdžiui, SalⅠ nereikia apsauginio pagrindo, EcoRⅤ reikia 1 apsauginio pagrindo, NotⅠ reikia 2 apsauginių pagrindų, o Hind Ⅲ reikia 3 apsauginių pagrindų.
LIC prideda uodegą
Visas LIC pavadinimas yra nuo ligavimo nepriklausomas klonavimas, klonavimo metodas, kurį Navogen išrado specialiai savo pET vektoriaus daliai.LIC metodu paruoštas pET nešiklis turi nekomplementarius 12-15 bazių vienos grandinės lipnius galus, kurie papildo atitinkamus lipnius galus ant tikslinio intarpo fragmento.Amplifikacijos tikslais įterpto fragmento pradmenų 5′ seka turėtų papildyti LIC vektorių.3′→5′ ekstranektinis T4 DNR polimerazės aktyvumas po trumpo laiko gali sudaryti vienos grandinės lipnų galą ant įterpto fragmento.Kadangi produktas gali būti sudarytas tik iš abipusio paruošto intarpo fragmento ir vektoriaus atkaitinimo, šis metodas yra labai greitas ir efektyvus bei yra nukreiptas klonavimas.
Nukreiptas TA klonas pridėti uodegą
TA klonavimas negalėjo nukreipti fragmento į vektorių, todėl vėliau Invitrogen pristatė vektorių, galintį nukreipti klonavimą, kurio viename gale buvo keturios iškilios GTGGS bazės.Todėl kuriant PGR pradmenis, reikia atitinkamai pridėti papildomas sekas, kad fragmentai galėtų būti „orientuoti“.
Jei trūksta laiko, galite išbandyti tiesioginę sintezę, sujungdami geną su vektoriumi, o tai yra tai, ką muziejininkai vadiname ET geno sinteze.
D. In-Fusion klonavimo metodas
Nereikia ligazės, nereikia ilgos reakcijos.Kol įvedama seka abiejuose linijinio vektoriaus galuose Kuriant pradmenis, tada PGR produktas ir tiesinis vektorius pridedami į infuzijos fermento tirpalą, kuriame yra BSA, ir pusvalandžiui laikomi kambario temperatūroje, galima atlikti transformaciją.Šis metodas ypač tinka didelės apimties konvertavimui.
10. Sujungti gruntą
Kartais apie pradmenų dizainą žinoma tik ribota sekos informacija.Pavyzdžiui, jei žinoma tik aminorūgščių seka, galima sukurti susiliejantį pradmenį.Sujungimo pradmenys yra skirtingų sekų mišinys, atspindintis visas skirtingas bazines galimybes, kurios koduoja vieną aminorūgštį.Norėdami padidinti specifiškumą, galite remtis kodono naudojimo lentele, kad sumažintumėte aneksiją pagal skirtingų organizmų bazinio naudojimo nuostatas.Hipoksantiną galima derinti su visomis bazėmis, kad sumažėtų grunto atkaitinimo temperatūra.Nenaudokite pridėtų bazių 3′ pradmens gale, nes pakanka paskutinių 3 bazių atkaitinimo 3′ gale, kad PGR būtų pradėta netinkamoje vietoje.Naudojamos didesnės pradmenų koncentracijos (nuo 1 μM iki 3 μM), nes daugelio aneksijos mišinių pradmenys nėra specifiniai tiksliniam šablonui.
PGR žaliavoskontrolė
1. Grunto kiekis
Kiekvieno pradmens koncentracija yra 0,1–1 umol arba 10–100 pmol.Geriau gauti reikiamą rezultatą su mažiausiu grunto kiekiu.Didelė pradmenų koncentracija sukels neatitikimą ir nespecifinį amplifikaciją bei padidins dimerų susidarymo galimybę tarp pradmenų.
2. Grunto koncentracija
Pradmenų koncentracija turi įtakos specifiškumui.Optimali pradmenų koncentracija paprastai yra nuo 0,1 iki 0,5 μM.Didesnė pradmenų koncentracija lemia nespecifinių produktų amplifikaciją.
3. Grunto atkaitinimo temperatūra
Kitas svarbus gruntų parametras yra lydymosi temperatūra (Tm).Tai temperatūra, kai 50% pradmenų ir komplementarių sekų yra dvigrandės DNR molekulės.Tm reikalingas PGR atkaitinimo temperatūrai nustatyti.Idealiu atveju atkaitinimo temperatūra yra pakankamai žema, kad būtų užtikrintas efektyvus pradmenų sujungimas su tiksline seka, tačiau pakankamai aukšta, kad sumažintų nespecifinį surišimą.Tinkama atkaitinimo temperatūra nuo 55 ℃ iki 70 ℃.Atkaitinimo temperatūra paprastai nustatoma 5 ℃ žemesnė nei grunto Tm.
Yra kelios Tm nustatymo formulės, kurios labai skiriasi priklausomai nuo naudojamos formulės ir pradmenų sekos.Kadangi dauguma formulių pateikia apskaičiuotą Tm vertę, visos atkaitinimo temperatūros yra tik pradinis taškas.Specifiškumą galima pagerinti analizuojant keletą reakcijų, kurios palaipsniui didina atkaitinimo temperatūrą.Pradėkite žemiau apskaičiuotos Tm-5 ℃ ir palaipsniui didinkite atkaitinimo temperatūrą 2 ℃ žingsniu.Aukštesnė atkaitinimo temperatūra sumažins pradmenų dimerų ir nespecifinių produktų susidarymą.Siekiant geriausių rezultatų, dviejų pradmenų Tm vertės turi būti apytikslės.Jei pradmenų porų Tm skirtumas yra didesnis nei 5 ℃, pradmenys parodys reikšmingą klaidingą paleidimą, naudojant žemesnę atkaitinimo temperatūrą cikle.Jei du pradmenys Tm skiriasi, nustatykite atkaitinimo temperatūrą 5 ℃ žemesnę nei mažiausia Tm.Arba, siekiant padidinti specifiškumą, pirmiausia galima atlikti penkis ciklus esant aukštesnei Tm atkaitinimo temperatūrai, o po to likusieji ciklai atkaitinimo temperatūroms, skirtoms žemesnei Tm.Tai leidžia gauti dalinę paskirties šablono kopiją esant griežtoms sąlygoms.
4. Grunto grynumas ir stabilumas
Standartinis pasirinktinių pradmenų grynumas yra tinkamas daugeliui PGR programų.Benzoilo ir izobutililo grupių pašalinimas iš druskų yra minimalus, todėl netrukdo PGR.Kai kurias programas reikia išvalyti, kad sintezės procese būtų pašalintos ne viso ilgio sekos.Šios sutrumpintos sekos atsiranda todėl, kad DNR sintezės chemijos efektyvumas nėra 100%.Tai žiedinis procesas, kurio metu naudojamos kartotinės cheminės reakcijos, kai pridedama kiekviena bazė, kad DNR būtų nuo 3′ iki 5′.Galite nepavykti bet kuriame cikle.Ilgesni pradmenys, ypač didesni nei 50 bazių, turi didelę sutrumpintų sekų dalį ir gali tekti išvalyti.
Gruntų išeigai įtakos turi sintetinės chemijos efektyvumas ir gryninimo metodas.Visos biofarmacijos įmonės, tokios kaip Cytology ir Shengong, naudoja minimalų OD vienetą, kad užtikrintų bendrą oligonukleozido išeigą.Individualūs gruntai siunčiami sausų miltelių pavidalu.Geriausia pradmenis iš naujo ištirpinti TE, kad galutinė koncentracija būtų 100 μM.TE yra geresnis nei dejonizuotas vanduo, nes vandens pH dažnai yra rūgštus ir sukels oligonukleozidų hidrolizę.
Gruntų stabilumas priklauso nuo laikymo sąlygų.Sausi milteliai ir ištirpę gruntai turi būti laikomi -20 ℃ temperatūroje.Gruntai, ištirpinti TE, kai koncentracija didesnė nei 10 μM, gali būti stabiliai laikomi -20 ℃ temperatūroje 6 mėnesius, bet gali būti laikomi tik kambario temperatūroje (nuo 15 ℃ iki 30 ℃) trumpiau nei 1 savaitę.Sausus miltelinius gruntus galima laikyti -20 C temperatūroje ne trumpiau kaip 1 metus, o kambario temperatūroje (15 C – 30 C) iki 2 mėnesių.
5. Fermentai ir jų koncentracijos
Šiuo metu naudojama Taq DNR polimerazė iš esmės yra genų inžinerijos fermentas, kurį sintetina koliforminės bakterijos.Fermento kiekis, reikalingas tipinei PGR reakcijai katalizuoti, yra apie 2,5 U (nurodomas bendras 100 ul reakcijos tūris).Jei koncentracija yra per didelė, tai gali sukelti nespecifinį stiprinimą;jei koncentracija per maža, sumažės sintetinio produkto kiekis.
6. DNTP kokybė ir koncentracija
dNTP kokybė yra glaudžiai susijusi su PGR amplifikacijos koncentracija ir efektyvumu.dNTP milteliai yra granuliuoti, o netinkamai laikant jų kintamumas praranda savo biologinį aktyvumą.dNTP tirpalas yra rūgštus ir turėtų būti naudojamas didelės koncentracijos, su 1M NaOH arba 1M Tris.HCL buferiniu tirpalu, kad jo pH būtų sureguliuotas iki 7,0 ~ 7,5, nedidelis kiekis antrinės pakuotės, užšaldytas -20 ℃.Daugkartinis užšaldymas ir atšildymas pablogins dNTP.PGR reakcijos metu dNTP turėtų būti 50–200 umol/l.Ypač atkreiptinas dėmesys į tai, kad keturių DNTPS koncentracija būtų vienoda (vienodo molio preparatas).Jei kurio nors iš jų koncentracija skirsis nuo kitų (didesnė arba mažesnė), atsiras neatitikimas.Per maža koncentracija sumažins PGR produktų išeigą.dNTP gali derintis su Mg2+ ir sumažinti laisvojo Mg2+ koncentraciją.
7. Šablono (taikinio geno) nukleorūgštis
Šablono nukleino rūgšties kiekis ir gryninimo laipsnis yra viena iš pagrindinių PGR sėkmės ar nesėkmės grandžių.Tradiciniai DNR gryninimo metodai paprastai naudoja SDS ir proteazę K mėginiams virškinti ir šalinti.Pagrindinės SDS funkcijos yra: ištirpinti lipidus ir baltymus ant ląstelės membranos, taip sunaikinant ląstelės membraną tirpinant membranos baltymus, bei disocijuoti ląstelėje esančius branduolinius baltymus, SDS taip pat gali jungtis su baltymais ir nusodinti;Proteazė K gali hidrolizuoti ir virškinti baltymus, ypač su DNR susietus histonus, o tada naudoti organinį tirpiklį fenolį ir chloroformą baltymams ir kitiems ląstelių komponentams ekstrahuoti, o etanoliui arba izopropilo alkoholiui nusodinti nukleorūgštį.Išskirta nukleorūgštis gali būti naudojama kaip PGR reakcijų šablonas.Bendrojo klinikinio aptikimo mėginiams greitas ir paprastas metodas gali būti naudojamas ląstelėms ištirpinti, patogenams lizuoti, baltymams virškinti ir pašalinti iš chromosomų į laisvus tikslinius genus ir tiesiogiai naudojamas PGR amplifikacijai.RNR šablono ekstrakcijai paprastai naudojamas guanidino izotiocianato arba proteazės K metodas, kad RNazė nesuardytų RNR.
8.Mg2+ koncentracija
Mg2+ turi reikšmingos įtakos PGR amplifikacijos specifiškumui ir išeigai.Bendroje PGR reakcijoje, kai įvairių dNTP koncentracija yra 200 umol/L, atitinkama Mg2+ koncentracija yra 1,5 ~ 2,0 mmol/L.Mg2+ koncentracija per didelė, reakcijos specifiškumas mažėja, atsiranda nespecifinė amplifikacija, per maža koncentracija sumažins Taq DNR polimerazės aktyvumą, dėl to sumažės reakcijos produktai.
Magnio jonai veikia kelis PGR aspektus, pvz., DNR polimerazės aktyvumą, kuris turi įtakos derliui;Kitas pavyzdys yra pradmenų atkaitinimas, kuris turi įtakos specifiškumui.dNTP ir šablonas jungiasi prie magnio jonų, todėl sumažėja laisvo magnio jonų kiekis, reikalingas fermento veiklai.Optimali magnio jonų koncentracija skiriasi skirtingoms pradmenų poroms ir šablonams, tačiau tipinė PGR pradinė koncentracija su 200 μM dNTP yra 1,5 mM (pastaba: kiekybinei PGR realiuoju laiku naudokite 3–5 mM magnio jonų tirpalą su fluorescenciniu zondu).Didesnės laisvųjų magnio jonų koncentracijos padidina derlių, bet taip pat padidina nespecifinį stiprinimą ir sumažina tikslumą.Norint nustatyti optimalią koncentraciją, magnio jonų titravimas buvo atliktas 0,5 mM žingsniais nuo 1 mM iki 3 mM.Norint sumažinti priklausomybę nuo magnio jonų optimizavimo, galima naudoti Platinum Taq DNR polimerazę.Platinum Taq DNR polimerazė gali išlaikyti funkciją didesniame magnio jonų koncentracijų diapazone nei Taq DNR polimerazė, todėl ją reikia mažiau optimizuoti.
9. Pcr skatinantys priedai
Atkaitinimo temperatūros, pradmenų konstrukcijos ir magnio jonų koncentracijos optimizavimas yra pakankamas, kad daugumos šablonai būtų labai specifiniai sustiprinti;tačiau kai kuriems šablonams, įskaitant tuos, kuriuose yra daug GC, reikia papildomų priemonių.Priedai, turintys įtakos DNR lydymosi temperatūrai, yra dar vienas būdas pagerinti produkto specifiškumą ir išeigą.Norint pasiekti geriausių rezultatų, būtina visiškai denatūruoti šabloną.
Be to, antrinė struktūra apsaugo nuo pradmenų prisijungimo ir fermento išplėtimo.
PGR priedai, įskaitant formamidą, DMSO, gliceriną, betainą ir PCRx stiprinimo tirpalą, sustiprina amplifikaciją.Galimas jų mechanizmas yra sumažinti lydymosi temperatūrą, taip palengvinant pradmenų susijungimą ir padedant DNR polimerazės išplėtimui per antrinės struktūros sritį.PCRx sprendimas turi ir kitų privalumų.Minimalus magnio jonų optimizavimas reikalingas naudojant Platinum Taq DNR polimerazę ir Platinum Pfx DNR polimerazę.Taigi, Platinum technika derinama su priedu, siekiant padidinti specifiškumą, kartu sumažinant trečiojo metodo – magnio jonų optimizavimo – priklausomybę.Siekiant geriausių rezultatų, reikia optimizuoti priedų, ypač DMSO, formamido ir glicerolio, koncentraciją, kurie slopina Taq DNR polimerazę.
10. Karšta pradžia
Karšto paleidimo PGR yra vienas iš svarbiausių būdų, kaip pagerinti PGR specifiškumą, be gero pradmenų dizaino.Nors optimali Taq DNR polimerazės pailgėjimo temperatūra yra 72 ℃, polimerazė išlieka aktyvi kambario temperatūroje.Taigi, kai ruošiant PGR reakciją ir terminio ciklo pradžioje laikymo temperatūra yra žemesnė už atkaitinimo temperatūrą, susidaro nespecifiniai produktai.Susiformavę šie nespecifiniai produktai efektyviai sustiprinami.Karštas paleidimo PGR yra ypač efektyvus, kai pradmenų projektavimui naudojamos vietos yra ribojamos genetinių elementų, tokių kaip mutacijos, ekspresijos klonavimas arba genetinių elementų, naudojamų DNR inžinerijai, konstravimas ir manipuliavimas.
Įprastas Taq DNR polimerazės aktyvumo ribojimo būdas yra paruošti PGR reakcijos tirpalą ant ledo ir įdėti į pašildytą PGR aparatą.Šis metodas yra paprastas ir nebrangus, tačiau jis neužbaigia fermento aktyvumo, todėl visiškai nepanaikina nespecifinių produktų amplifikacijos.
Terminis užpildymas lėtina DNR sintezę, nes slopina pagrindinį komponentą, kol PGR aparatas pasiekia denatūravimo temperatūrą.Dauguma rankinio terminio inicijavimo metodų, įskaitant atidėtą Taq DNR polimerazės pridėjimą, yra sudėtingi, ypač naudojant didelio našumo programas.Taikant kitus terminio gruntavimo metodus, naudojamas vaško skydas, skirtas apgaubti pagrindinį komponentą, įskaitant magnio jonus ar fermentus, arba fiziškai atskirti reaktyvius komponentus, tokius kaip šablonai ir buferiai.Terminio ciklo metu įvairūs komponentai išsiskiria ir susimaišo, kai vaškas tirpsta.Kaip ir rankinis karšto paleidimo metodas, vaško skydo metodas yra sudėtingas ir linkęs į užteršimą, todėl netinka didelio našumo reikmėms.
Platinos DNR polimerazė yra patogi ir efektyvi automatiniam karšto paleidimo PGR.Platinum Taq DNR polimerazė susideda iš rekombinantinės Taq DNR polimerazės, sujungtos su monokloniniu antikūnu prieš Taq DNR polimerazę.Antikūnai gaminami naudojant PGR, kad slopintų fermentų aktyvumą ilgai palaikant temperatūrą.Taq DNR polimerazė buvo išleista į reakciją per 94 ℃ denatūravimo etapo izoliaciją, atkuriant visą polimerazės aktyvumą.Priešingai nei chemiškai modifikuota Taq DNR polimerazė terminei iniciacijai, platinos fermentui nereikia ilgos izoliacijos 94 ℃ temperatūroje (10–15 minučių), kad aktyvuotų polimerazę.Naudojant PlatinumTaq DNR polimerazę, 90% Taq DNR polimerazės aktyvumo buvo atkurta po 2 minučių 94 ℃ temperatūroje.
11. Nest-PGR
Vienas po kito einantys amplifikacijos raundai naudojant įdėtus pradmenis gali pagerinti specifiškumą ir jautrumą.Pirmasis raundas yra standartinis 15–20 ciklų stiprinimas.Nedidelė pradinio amplifikacijos produkto dalis buvo atskiesta nuo 100 iki 1000 kartų ir įtraukta į antrąjį amplifikacijos etapą 15-20 ciklų.Arba pradinio amplifikuoto produkto dydį galima nustatyti gryninant geliu.Antrajame amplifikacijos etape naudojamas įdėtas pradmuo, kuris gali prisijungti prie tikslinės sekos pirmojo pradmens viduje.Naudojant įdėtą PGR, sumažėja kelių tikslinių vietų amplifikacijos galimybė, nes yra nedaug tikslinių sekų, papildančių abu pradmenų rinkinius.Tas pats bendras ciklų skaičius (nuo 30 iki 40) su tais pačiais pradmenimis sustiprino nespecifines vietas.Įdėtasis PGR padidina ribotų tikslinių sekų (pvz., retų mrnas) jautrumą ir pagerina sudėtingų PCRS (pvz., 5′ RACE) specifiškumą.
12. Mažėjanti PGR
Mažėjanti PGR pagerina specifiškumą, naudojant griežtas atkaitinimo sąlygas per pirmuosius kelis PGR ciklus.Ciklas pradedamas esant atkaitinimo temperatūrai, maždaug 5 ℃ aukštesnei už apskaičiuotą Tm, tada kiekvienas ciklas sumažinamas 1 ℃ iki 2 ℃, kol atkaitinimo temperatūra bus žemesnė nei Tm 5 ℃.Bus sustiprintas tik didžiausią homologiją turintis paskirties šablonas.Šie produktai ir toliau plečiasi vėlesniais ciklais, išstumdami sustiprintus nespecifinius produktus.Mažėjanti PGR yra naudinga metodams, kai homologijos laipsnis tarp pradmenų ir tikslinio šablono nėra žinomas, pvz., AFLP DNR pirštų atspaudų ėmimas.
Susiję PGR rinkiniai
2 × PGR herojusTMMix sistema turi didesnį toleranciją PGR inhibitoriams nei įprasta PCR Mix sistema ir gali lengvai susidoroti su įvairių sudėtingų šablonų PGR amplifikavimu.Dėl unikalios reakcijos sistemos ir didelio efektyvumo Taq Hero PGR reakcija pasižymi didesniu amplifikacijos efektyvumu, specifiškumu ir jautrumu.
Didesnis stiprinimo efektyvumas
Jis pasižymi 5'→3' DNR polimerazės aktyvumu ir 5'→3' egzonukleazės aktyvumu, be 3'→5' egzonukleazės aktyvumo.
Realaus laiko PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I rinkinys
Specifinis optimizuotas buferis ir karšto paleidimo Taq fermentas gali užkirsti kelią nespecifiniam amplifikacijai ir pradmenų dimerų susidarymui
Didelis jautrumas – galima aptikti mažas šablono kopijas
RT-PCR Easyᵀᴹ I (vienas žingsnis)
Rinkinyje naudojamas unikalus Foregene atvirkštinės transkripcijos reagentas ir Foregene HotStar Taq DNR polimerazė kartu su unikalia reakcijos sistema, siekiant efektyviai pagerinti amplifikacijos efektyvumą ir reakcijos specifiškumą.
Paskelbimo laikas: 2023-09-09
