Nėra stiprinimo signalų

1. Rinkinyje esanti Taq DNR polimerazė praranda savo aktyvumą dėl netinkamo rinkinio laikymo arba pasibaigus jo galiojimo laikui.
Rekomendacija: Patvirtinkite rinkinio laikymo sąlygas;iš naujo įdėkite atitinkamą Taq DNR polimerazės kiekį į PGR sistemą arba įsigykite naują realaus laiko PGR rinkinį susijusiems eksperimentams.

2.DNR šablone yra daug Taq DNR polimerazės inhibitorių.
Pasiūlymas: iš naujo išvalykite šabloną arba sumažinkite naudojamo šablono kiekį.

3. Mg2+ koncentracija netinka.
Rekomendacija: mūsų teikiamo 2× Real PCR mišinio Mg2+ koncentracija yra 3,5 mM.Tačiau kai kurių specialių pradmenų ir šablonų Mg2+ koncentracija gali būti didesnė.Todėl galite tiesiogiai pridėti MgCl2, kad optimizuotumėte Mg2+ koncentraciją.Norint optimizuoti, rekomenduojama kiekvieną kartą padidinti Mg2+ 0,5 mM.

4. PGR amplifikacijos sąlygos netinkamos, o pradmenų seka arba koncentracija yra netinkama.
Pasiūlymas: patvirtinkite pradmenų sekos teisingumą ir gruntas nebuvo sugadintas;jei stiprinimo signalas nėra geras, pabandykite sumažinti atkaitinimo temperatūrą ir atitinkamai sureguliuokite pradmenų koncentraciją.

5. Šablono kiekis yra per mažas arba per daug.
Rekomendacija: Atlikite šablono linearizacijos gradiento praskiedimą ir pasirinkite šablono koncentraciją su geriausiu PGR efektu realiojo laiko PGR eksperimentui.

NTC fluorescencinė vertė per didelė

1. Reagento užterštumas, atsiradęs eksploatacijos metu.
Rekomendacija: Realaus laiko PGR eksperimentams pakeiskite naujais reagentais.

2. Užteršimas įvyko ruošiant PGR reakcijos sistemą.
Rekomendacija: Eksploatacijos metu imkitės būtinų apsaugos priemonių, tokių kaip: mūvėkite latekso pirštines, naudokite pipetės antgalį su filtru ir pan.

3. Pradmenys suskaidomi, o pradmenų skilimas sukels nespecifinę amplifikaciją.
Patarimas: naudokite SDS-PAGE elektroforezę, kad nustatytumėte, ar pradmenys yra suskaidyti, ir pakeiskite juos naujais pradmenimis, kad atliktumėte realaus laiko PGR eksperimentus.

Pradmenų dimeris arba nespecifinė amplifikacija

1. Mg2+ koncentracija netinka.
Rekomendacija: mūsų teikiamo 2× Real PCR EasyTM Mix Mg2+ koncentracija yra 3,5 mM.Tačiau kai kurių specialių pradmenų ir šablonų Mg2+ koncentracija gali būti didesnė.Todėl galite tiesiogiai pridėti MgCl2, kad optimizuotumėte Mg2+ koncentraciją.Norint optimizuoti, rekomenduojama kiekvieną kartą padidinti Mg2+ 0,5 mM.

2. PGR atkaitinimo temperatūra per žema.
Patarimas: kiekvieną kartą padidinkite PGR atkaitinimo temperatūrą 1 ℃ arba 2 ℃.

3. PGR produktas per ilgas.
Rekomendacija: Realaus laiko PGR produkto ilgis turi būti nuo 100 iki 150 bp, ne daugiau kaip 500 bp.

4. Pradmenys suskaidomi, o pradmenų skilimas lems specifinio amplifikacijos atsiradimą.
Patarimas: naudokite SDS-PAGE elektroforezę, kad nustatytumėte, ar pradmenys yra suskaidyti, ir pakeiskite juos naujais pradmenimis, kad atliktumėte realaus laiko PGR eksperimentus.

5. PGR sistema netinkama arba sistema per maža.
Patarimas: PGR reakcijos sistema per maža, todėl aptikimo tikslumas sumažės.Norint pakartotinai atlikti realiojo laiko PGR eksperimentą, geriausia naudoti reakcijos sistemą, kurią rekomenduoja kiekybinis PGR instrumentas.

Prastas kiekybinių verčių pakartojamumas

1. Prietaisas veikia netinkamai.
Patarimas: tarp kiekvienos instrumento PGR skylės gali būti klaidų, todėl temperatūros valdymo arba aptikimo metu atkuriamumas prastas.Patikrinkite pagal atitinkamo prietaiso instrukcijas.

2. Mėginio grynumas nėra geras.
Rekomendacija: nešvarūs mėginiai blogai atkuria eksperimentą, įskaitant šablono ir pradmenų grynumą.Geriausia iš naujo išgryninti šabloną, o pradmenis geriausia išvalyti naudojant SDS-PAGE.

3. PGR sistemos paruošimo ir saugojimo laikas per ilgas.
Patarimas: naudokite realiojo laiko PGR sistemą PGR eksperimentui iš karto po paruošimo ir nepalikite jos per ilgai.

4. PGR amplifikacijos sąlygos netinkamos, o pradmenų seka arba koncentracija yra netinkama.
Pasiūlymas: patvirtinkite pradmenų sekos teisingumą ir gruntas nebuvo sugadintas;jei stiprinimo signalas nėra geras, pabandykite sumažinti atkaitinimo temperatūrą ir atitinkamai sureguliuokite pradmenų koncentraciją.

5. PGR sistema netinkama arba sistema per maža.
Patarimas: PGR reakcijos sistema per maža, todėl aptikimo tikslumas sumažės.Norint pakartotinai atlikti realiojo laiko PGR eksperimentą, geriausia naudoti reakcijos sistemą, kurią rekomenduoja kiekybinis PGR instrumentas.