RT-qPCR eksperimentas apima RNR ekstrahavimą ir kokybės įvertinimą, atvirkštinę transkripciją ir qPCR tris etapus, kiekviename žingsnyje yra daug atsargumo priemonių, mes išsamiai pristatysime toliau.

Ⅰ.RNR kokybės vertinimas

Atliekant RT-qPCR eksperimentą, baigus RNR ekstrakciją, reikia įvertinti RNR kokybę, o tolesnis eksperimentas gali būti atliktas tik jį kvalifikavus.Vertinimo metodai apima spektrofotometrą, Agilent gelio elektroforezę, Agilent 2100 analizę, tarp kurių dažniausiai naudojamas spektrofotometras ir agarozės gelio elektroforezės metodas.Reikėtų pažymėti, kad šie du metodai turi būti naudojami kartu, siekiant užbaigti RNR koncentracijos, grynumo ir vientisumo aptikimą ir analizę, kad būtų užtikrinta RNR kokybė.

Susijęs RNR izoliavimo rinkinys: 

Ląstelių bendros RNR izoliacijos rinkinys

Labai išgryninta ir aukštos kokybės bendroji RNR gali būti gaunama iš įvairių kultivuotų ląstelių per 11 min.

Gyvūnų bendros RNR izoliacijos rinkinys

Greitai ir efektyviai išgaukite labai gryną ir kokybišką bendrą RNR iš įvairių gyvūnų audinių.

Spektrofotometras:

Spektrofotometras daugiausia naudojamas RNR koncentracijai ir grynumui nustatyti, tačiau jis negali aptikti RNR ir genomo liekanų vientisumo.Tarp jų A260/280 ir A260/230 yra svarbūs RNR grynumo nustatymo parametrai, o RNR grynumą galima nustatyti pagal jų verčių svyravimus:

1. 1,9< A260/280< 2,1, tai rodo, kad RNR grynumas geras;A260/280<1,9, o tai rodo, kad RNR gali būti baltymo liekanų;A260/280>2.1, rodantis galimą dalinį RNR skilimą, kurį galima dar patvirtinti agarozės gelio elektroforeze.

2. 2,0< A260/230< 2,2, tai rodo, kad RNR grynumas geras;A260/230< 2,0, o tai rodo, kad RNR gali būti organinių reagentų likučių, tokių kaip fenoliai, etanolis arba cukrus.

Agarozės gelio elektroforezė:

Agarozės gelio elektroforezės tyrimas gali išanalizuoti RNR vientisumą, genomo ir baltymų likučius, bet negali tiksliai nustatyti RNR koncentracijos ar aptikti organinių reagentų likučių.Paimkite, pavyzdžiui, eukariotų RNR šablonus:

1. RNR buvo atlikta agarozės gelio elektroforezė.Jei gelio žemėlapyje buvo tik trys atskiros 28sRNR, 18sRNR ir 5,8sRNR juostos, tai rodo, kad išgauta RNR yra nepažeista.Jei yra vilkimo reiškinys, tai rodo dalinį RNR skilimą.

2. Jei tarp klijų skylės ir 28sRNR juostos yra viena ryški juosta, gali būti genominės DNR liekanos.

3. Jei klijų skylėje atsiranda juostelių, tai rodo, kad gali būti baltymų ir kitų stambiamolekulinių medžiagų likučių.

Ⅱ. Atvirkštinė transkripcija

Užbaigus RNR ekstrakciją, vėlesniems eksperimentams ji turi būti pakeista į cDNR, todėl būtinas atstatymo veiksmas.Atvirkštinė transkripcija bus įdiegta pasirinkus atvirkštinę transkriptazę ir pradmenį:

Atvirkštinės transkriptazės pasirinkimas:

Tipiškos atvirkštinės transkriptazės yra AMV RTazė ir MMLV RTazė.AMV RTazės RNazė H turi stiprų aktyvumą, trumpą sintezės trukmę, mažą sintezės kiekį ir gerą terminį stabilumą (42 ~ 55 ℃).MMLV RTazės RNazės H aktyvumas yra silpnas, sintezės trukmė ilga, sintezės kiekis didelis, o terminis stabilumas prastas (37 ~ 42 ℃).

Kadangi RNazės H fermentas atlieka RNR šablono skaidymo funkciją, atvirkštinės transkripcijos metu pirmiausia reikėtų pasirinkti MMLV su silpnu RNazės H aktyvumu, o po vėlesnės genų inžinerijos MMLV terminis stabilumas pasiekė kokybinį šuolį.Vartojant ForegenąForeasy atvirkštinė transkriptazė (M-MLV atvirkštinei transkripcijai) Pavyzdžiui, tai nauja atvirkštinė transkriptazė, ekspresuojama E. coli inžinerijos būdu sukurtose bakterijose naudojant genetinės rekombinacijos technologiją.Tai rekombinantinė DNR polimerazė, sintezuojanti komplementarią DNR grandinę iš vienos grandinės RNR, DNR arba RNR:DNR hibrido.Jis neturi RNazės H aktyvumo, stipraus stabilumo, stipraus RNR afiniteto ir didelio aptikimo jautrumo.

 

Foreasy atvirkštinė transkriptazė (M-MLV atvirkštinei transkripcijai)

Grunto pasirinkimas:

Paprastai RT pradmenys skirstomi į tris kategorijas: oligo dT, atsitiktiniai pradmenys ir genų specifiniai pradmenys.Pasirinkite tinkamus gruntus naudoti pagal skirtingus eksperimentinius reikalavimus.

1. Jei šablonas yra eukariotinės kilmės ir vėlyvoji cDNR naudojama įprastinei PGR amplifikacijai, rekomenduojama naudoti Oligo (dT);Jei tolesnis eksperimentas naudojamas tik qPCR, Oligo (dT) rekomenduojama maišyti su atsitiktiniais pradmenimis, kad būtų pagerintas atvirkštinės transkripcijos efektyvumas.

2. Jei šablonas yra iš prokariotų, atvirkštinei transkripcijai reikia pasirinkti atsitiktinius pradmenis arba genų specifinius pradmenis.

Ⅲ.qPCR

Fluorescencijos kiekybinis įvertinimas daugiausia atliekamas parenkant kiekybinius metodus, pradmenų projektavimo principus, ROX pasirinkimą, reakcijos sistemos konfigūraciją ir reakcijos sąlygų nustatymą ir kt.

Kiekybinių metodų pasirinkimas:

Kiekybiniai metodai skirstomi į santykinius kiekybinius ir absoliučiuosius kiekybinius metodus.Santykinis kiekybinis įvertinimas gali būti naudojamas norint nustatyti tam tikrų gydymo metodų poveikį genų ekspresijai, nustatyti genų ekspresijos skirtumą skirtingu laiku ir palyginti genų ekspresijos skirtumą skirtinguose audiniuose.Absoliutus kiekybinis įvertinimas gali nustatyti nukleino rūgšties kiekį viruse ir pan.Atlikdami eksperimentus, turime pasirinkti tinkamus kiekybinius metodus pagal savo eksperimentus.

Grunto projektavimo principai:

qPCR pradmenų dizainas yra tiesiogiai susijęs su amplifikacijos efektyvumu ir produkto specifiškumu.Todėl tinkamas gerų pradmenų sukūrimas yra pirmasis sėkmingo qPCR žingsnis.Projektuojant gruntą, laikantis įprasto grunto dizaino principo, reikia atkreipti dėmesį į šiuos principus:

1. Tikslinio fragmento ilgis kontroliuojamas tarp 100 ir 300 bp;

2. Kryžminis egzoninis dizainas siekiant išvengti genominės DNR įtakos;

3. Suprojektuoti pradmenys turi būti išbandyti dėl amplifikacijos efektyvumo ir tik tada, kai amplifikacijos efektyvumas pasiekia standartą (90-110%), galima juos naudoti kiekybiniams eksperimentams;

4. Pradmenų koncentracija paprastai optimizuojama nuo 0,1 uM iki 1,0 uM.

Pasirinkimas išROX:

Kiekybinės reakcijos metu ROX gali vienodai reguliuoti optinio kelio skirtumą, pipetavimo klaidą arba tūrio skirtumą, atsirandantį dėl garavimo ir kondensacijos, pagerindamas rezultatų pakartojamumą.Tačiau reikia pažymėti, kad ROX pasirinkimas yra susijęs su instrumentu.Jei qPCR prietaisas turi funkciją automatiškai koreguoti skirtumą tarp skylių, jam nereikia pridėti ROX;kitu atveju reikia pridėti ROX pataisą.Mažieji partneriai, pirkdami reagentus, turi vadovautis naudojamu prietaisu, kad pasirinktų teisingą ROX, kad būtų išvengta vėlesnių klaidų.

Reakcijos sistemos paruošimas:

Pageidautina, kad reakcijos tūris būtų 20 ul ir 50 ul.Kuriant sistemą reikia atkreipti dėmesį į šiuos dalykus:

1. Reakcijos sistemą reikia paruošti vėdinant itin švarų darbastalį, naujas ddH₂Kiekvienam eksperimentui naudojamas O;

2. Kiekvienam eksperimentui reikia paruošti NTC, kad būtų patikrinta, ar sistemoje nėra taršos, ir kiekvienai pradmenų porai ruošiant sistemą reikia atlikti NTC;

3. Norint nustatyti, ar RNR šablone yra gDNR liekanų, kiekvienam mėginiui aptikti galima paruošti NRT;

4. Rengiant sistemą vienam mėginiui rekomenduojama atlikti bent 3 techninius pakartojimus;

5. Kai šablonas yra cDNR, rekomenduojama praskiesti 5-10 kartų, kad sumažėtų atvirkštinės transkripcijos sistemos slopinamasis poveikis qPCR eksperimentui.Šablono kiekį geriau tirti pagal gradientą, kad CT reikšmė nukristų tarp 20–30;

6. Nustatykite reikiamą reakcijų skaičių, padidinkite 5-10% pagal reakcijų skaičių ir apskaičiuokite tūrio konfigūracijos skaičių;

7, sistema paruošta naudojant premikso principą, sumaišoma po centrifugavimo ir užtikrinama, kad nebūtų burbuliukų;

8, kiek įmanoma, pasirinkti pagalbines eksploatacines medžiagas.

Susijęs RT-qPCR rinkinys