Aptikimo specifiškumas

Daugeliu atvejų pradmenų projektavimo tikslas yra maksimaliai padidinti PGR specifiškumą.Tai lemia daugiau ar mažiau nuspėjama daugelio kintamųjų įtaka.Vienas svarbus kintamasis yra seka pradmens 3′ gale.

Svarbu tai, kad PGR tyrimai, sukurti specifiškumui, yra labiau linkę išlaikyti aukštą efektyvumą plačiame dinaminiame diapazone, nes tyrimas nesukuria nespecifinių amplifikacijos produktų, todėl konkuruoja su PGR reagentais arba slopina pagrindinę amplifikacijos reakciją.

Žinoma, kai kuriais atvejais specifiškumas nėra svarbiausias, pavyzdžiui, kai siekiama kiekybiškai įvertinti glaudžiai susijusius, bet skirtingus patogenus, reikalingi specialūs projektavimo, optimizavimo ir patikros standartai.

Lydymosi kreivė yra standartinis metodas amplikonų specifiškumui įvertinti, bent jau kalbant apie tai, ar sustiprinti vieną taikinį.Tačiau reikia pabrėžti, kad lydymosi kreivės gali būti klaidinančios, nes, pavyzdžiui, jas gali paveikti bendras neoptimalių pradmenų ir mažos šablono koncentracijos poveikis.

P5 |Lydymosi kreivė rodo Tm poslinkius, gautus iš dviejų skirtingų dviejų tikslinių DNR kiekių aptikimų.

A. Esant didesnėms koncentracijoms (ad)), po qPCR matavimo akivaizdaus pradmenų dimerio nėra.Kai šablono koncentracija sumažėja iki 50 kopijų (e), pradeda atsirasti nespecifinis produktas, kuris tampa vieninteliu gaminiu, kurio koncentracija yra mažesnė (f).

B. Bandymas užfiksavo tuos pačius Tms visoms tikslinėms koncentracijoms ir nebuvo akivaizdaus pradmenų dimero net esant mažiausia koncentracijai (5 kopijos).Naudojant šiuos du aptikimo metodus, NTC neaptikta amplifikacijos produktų.

P5 rodo tirpimo kreives, gautas naudojant mėginius, kuriuose šablono yra skirtingomis koncentracijomis.P 5a rodo, kad esant dviem mažiausioms koncentracijoms, pagamintų nespecifinių amplifikacijos produktų Tms yra mažesni nei specifinių amplikonų.

Akivaizdu, kad šis aptikimo metodas negali būti patikimai naudojamas aptikti taikinius, kurių koncentracija yra maža.

Įdomu tai, kad NTC, ty mėginiai be DNR, neužfiksavo (nespecifinių) amplifikacijos produktų, o tai rodo, kad foninė genominė DNR gali dalyvauti nespecifinėje amplifikacijoje / polimerizacijoje.

Kartais tokie foniniai pradmenys ir nespecifinė amplifikacija negali būti ištaisyti, tačiau dažnai įmanoma sukurti aptikimo metodą, kuris neturi nespecifinio amplifikacijos bet kurioje šablono koncentracijoje ir NTC (P 5b).

Čia net užregistravus tikslinės koncentracijos padidėjimą, kai Cq yra 35, bus sukurta specifinė tirpimo kreivė.Panašiai NTC neparodė nespecifinio amplifikacijos požymių.Kartais aptikimo elgsena gali priklausyti nuo motininio tirpalo, o tam tikrose buferinėse kompozicijose aptinkama tik nespecifinė amplifikacija, kuri gali būti susijusi su skirtingomis Mg2+ koncentracijomis.

Aptikimo stabilumas

Ta optimizavimas yra naudingas žingsnis empiriniame qPCR aptikimo patikrinimo ir optimizavimo procese.Jis tiesiogiai parodo pradmenų rinkinio tvirtumą, rodydamas temperatūrą (arba temperatūros diapazoną), kuri sukuria mažiausią Cq nestiprindama NTC.

Dviejų ar keturių kartų jautrumo skirtumas gali būti nesvarbus žmonėms, turintiems didelę mRNR ekspresiją, tačiau atliekant diagnostinius tyrimus, tai gali reikšti skirtumą tarp teigiamų ir klaidingai neigiamų rezultatų.

qPCR pradmenų Ta savybės gali labai skirtis.Kai kurie bandymai nėra labai tvirti ir, jei jie neatliekami esant optimaliai pradmenų Ta vertei, jie greitai subyrės.

Tai svarbu, nes tokio tipo aptikimas dažnai yra problemiškas realiame pasaulyje, o mėginio grynumas, DNR koncentracija ar kitos DNR buvimas gali būti netinkami.

Be to, tikslinis kopijų skaičius gali labai skirtis, o reagentai, plastikiniai indai ar instrumentai gali skirtis nuo tų, kurie buvo naudojami nustatant testą.

P6|Temperatūros gradientas rodo skirtingą PGR aptikimo patikimumą.

A. Naudokite Bioline Sensifast SYBR mastermix (katalogo numeris BIO-98050), kad atliktumėte iš žmogaus smegenų RNR gautos cDNR PGR.

B. Naudokite Bio-Rad CFX qPCR instrumentą, kad įrašytumėte apaleno amplifikacijos žemėlapį ir tirpimo kreivę (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1 stiprinimo grafikas ir lydymosi kreivė (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAP amplifikacijos grafikas ir ištirpimo kreivė (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs, užfiksuotas esant skirtingoms atkaitinimo temperatūroms, rodantis Cq skirtumą, užfiksuotą esant 7C temperatūros gradientui.

P 6 rodo tipišką nepageidaujamo testo rezultatą, kai qPCR buvo atlikta naudojant Tas gradientą tarp 59C ir 67C (P 6a), naudojant pradmenis trims žmogaus smegenims būdingiems genams.

Iš amplifikacijos grafiko matyti, kad Opalin pradmenys toli gražu nėra idealūs, nes jų optimalus Ta diapazonas yra labai siauras (6b pav.), ty Cqs yra plačiai išsibarstę, todėl Cqs yra žymiai lyginamas su jų optimaliu Cqs Low.

Šis aptikimo metodas yra nestabilus ir gali sukelti neoptimalų stiprinimą.Todėl ši gruntų pora turėtų būti perkurta.Be to, lydymosi kreivės analizė (įdėta) rodo, kad šio aptikimo metodo specifiškumas taip pat gali būti problemiškas, nes kiekvieno Ta lydymosi kreivė yra skirtinga.

P 6c parodytas ACSBG1 aptikimo metodas yra patikimesnis nei aukščiau pateiktas Opalin aptikimo metodas, tačiau jis vis dar toli gražu nėra idealus ir tikėtina, kad jį galima patobulinti.

Tačiau pabrėžiame, kad nėra būtino ryšio tarp tvirtumo ir specifiškumo, nes šiuo aptikimo metodu gauta tirpimo kreivė rodo tą pačią didžiausią vertę visuose Tas (įdėta).

Kita vertus, tvirtumo testas yra daug tolerantiškesnis ir sukuria panašius Cq įvairiuose Tas, kaip ir GFAP teste, parodytame P 6d.

Cqs skirtumas, gautas tame pačiame 8 laipsnių Celsijaus diapazone, yra mažesnis nei 1, o tirpimo kreivė (įdėta) patvirtina aptikimo charakteristikas šiame temperatūros diapazone.Verta paminėti, kad apskaičiuotas Tas ir tikrasis Ta diapazonas gali labai skirtis.

Yra daug gairių, skirtų padėti mokslininkams sukurti efektyvius pradmenis, kurių dauguma yra pagrįsti seniai nusistovėjusiomis taisyklėmis, o daug dėmesio buvo skirta 3′ pradmenų galams.Dažnai rekomenduojama įtraukti G arba C 3' gale ir du G arba C pagrindus (GC spaustuką), bet ne daugiau kaip du iš paskutinių 5 bazių.

Praktiškai šios taisyklės gali vadovautis tyrėjams, tačiau jos nebūtinai yra teisingos visomis aplinkybėmis.

P7 |3′ pradmens galas turi mažai įtakos specifiškumui ar efektyvumui.

A. Žmogaus HIF-1α (NM_181054.2) geno pradmenų padėtis.

B. Naudokite Agilent Brilliant III SYBR Green motininį tirpalą (kat. Nr. 600882), kad sustiprintumėte šešis bandomuosius elementus.

C. Amplifikacijos grafikas ir lydymosi kreivė, įrašyta Bio-Rad CFX qPCR prietaisu ir 3′galų pradmenimis.NTC rodomi raudonai.

D. Kiekvieno bandomojo elemento Cqs įrašas

Pavyzdžiui, rezultatas P 7 prieštarauja 3′galo taisyklei.Visi dizainai duoda iš esmės tuos pačius rezultatus, tik du pradmenų deriniai, lemiantys nespecifinį NTC amplifikaciją.

Tačiau negalime palaikyti GC klipo efekto, nes šiuo atveju naudojant A arba T daugiausiai 30 bazių specifiškumas nesumažėja.

C testas, kai F pradmuo baigiasi GGCC, užfiksavo Cqs NTC, o tai rodo, kad galbūt norėsite išvengti šių sekų 30 gale.Pabrėžiame, kad vienintelis būdas nustatyti geriausią pradmenų poros 3′galų seką yra eksperimentiškai įvertinti kai kuriuos pradmenis.

Stiprinimo efektyvumas

Svarbu tai, kad nors nespecifinis PGR aptikimas niekada negali tapti specifinis, amplifikacijos efektyvumą galima reguliuoti ir maksimaliai padidinti įvairiais būdais keičiant fermentą, motininį tirpalą, priedus ir ciklo sąlygas.

Norint įvertinti PGR aptikimo efektyvumą, geriausia naudoti serijinį praskiedimą, 10 arba 5 kartus didesnį už tikslinę nukleorūgštį, ty „standartinės kreivės metodą“.

Jei standartinei kreivei sukurti naudojami PGR amplikonai arba sintetiniai DNR taikiniai, šių taikinių serijiniai skiedimai turi būti maišomi su pastoviu foninės DNR kiekiu (pvz., genomo DNR).

P8 |Skiedimo kreivė PGR efektyvumui įvertinti.

A. Naudokite HIF-1 pradmenis: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ir R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ir Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalogo numeris 600882) PGR ir lydymosi kreivės sąlygoms.

B. 100 ng RNR buvo atvirkštinė transkribuota, praskiesta 2 kartus, o serijiniu būdu praskiesti cDNR mėginiai buvo atskiesti 5 kartus iki 1 ng žmogaus genominės DNR.Lydymosi kreivė parodyta įdėkle.

C. RT reakcija, skiedimas ir serijinis skiedimas buvo pakartotas antrajam cDNR mėginiui, ir rezultatai buvo panašūs.

P 8 rodomos dvi standartinės kreivės, naudojant tą patį aptikimo metodą dviejuose skirtinguose cDNR mėginiuose, rezultatas yra toks pat efektyvumas, apie 100%, o R2 reikšmė taip pat yra panaši, tai yra, eksperimentinių duomenų ir regresijos linijos arba duomenų tiesiškumo laipsnio atitikimo laipsnis.

Dvi standartinės kreivės yra palyginamos, bet ne visiškai vienodos.Jei tikslas yra tiksliai kiekybiškai įvertinti tikslą, reikia pažymėti, kad nepriimtina pateikti kopijų skaičiaus skaičiavimą nepaaiškinus neapibrėžtumo.

P9 |Matavimo neapibrėžtis, susijusi su kiekybiniu nustatymu naudojant standartinę kreivę.

A. Naudokite pradmenis, skirtus GAPDH (NM_002046), kad atliktumėte PGR ir lydymosi kreivės sąlygas.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ir R: TAACTGGTTGAGCACAGG ir Bioline Sensifast SYBR mastermix (katalogo numeris BIO-98050).

B. Amplifikacijos diagrama, lydymosi kreivė ir standartinė kreivė įrašyta Bio-Rad CFX qPCR prietaisu.

C. Standartinės kreivės grafikas ir 95 % pasikliautinasis intervalas (PI).

D. Trijų Cq verčių, gautų iš skiedimo kreivės, kopijų skaičius ir 95 % pasikliautinasis intervalas.

P 9 rodo, kad optimizuoto testo atveju vienos standartinės kreivės būdingas kintamumas yra maždaug 2 kartus (95 % pasikliautinasis intervalas, nuo minimalaus iki didžiausio), o tai gali būti mažiausias kintamumas, kurio galima tikėtis.

Susijęs produktas:

Cell Direct RT qPCR rinkinys

Mouse Tail Direct PCR rinkinys

Animal Tissue Direct PGR rinkinys