Pipetės antgalių ir EP vamzdelių sterilizavimas ir kt.

1. Paruoškite 0,1% (vieną tūkstantąją) DEPC (labai toksiška medžiaga) su dejonizuotu vandeniu, atsargiai naudokite traukos gaubte ir laikykite 4°C temperatūroje nuo šviesos;

DEPC vanduo yra grynas vanduo, apdorotas DEPC ir sterilizuotas aukštoje temperatūroje bei aukštu slėgiu.Išbandyta, kad jame nėra RNazės, DNazės ir proteinazės.

2. Pipetės antgalį ir EP vamzdelį įkiškite į 0,1 % DEPC ir įsitikinkite, kad pipetės antgalis ir EP vamzdelis užpildyti 0,1 % DEP.

3. Saugokite nuo šviesos, palikite pastovėti per naktį (12-24h)

4. Dėžutės, kurioje yra antgalis ir EP vamzdelis, nereikia mirkyti DEPC.Grubiai išėmę DEPC vandenį iš antgalio arba EP vamzdelio, supakuokite jį ir suvyniokite.

5. 121 laipsnis Celsijaus, 30min

6. 180 laipsnių Celsijaus, džiovinkite kelias valandas (mažiausiai 3 valandas)

Pastaba: a.Dirbdami su DEPC mūvėkite latekso pirštines ir kaukes!b, arba be DEPC sterilizacijos, 130 ℃, 90 min autoklave (daugelyje laboratorijų aukštoje temperatūroje sterilizuojama du kartus)

RNR ekstrahavimo svarstymai

Du pagrindiniai audinių RNR išskyrimo nesėkmės reiškiniai

RNR skilimas ir priemaišų likučiai audiniuose,Kalbant apie skaidymą, pirmiausia pažiūrėkime, kodėl iš kultivuotų ląstelių išgauta RNR nėra lengvai skaidoma.Esamuose RNR ekstrahavimo reagentuose yra komponentų, kurie greitai slopina Rnazę.Į kultivuojamas ląsteles įpilkite lizato ir tiesiog sumaišykite, visos ląstelės gali būti kruopščiai sumaišytos su lizatu ir ląstelės visiškai lizuojamos.Ląstelėms lizavus, lizate esančios veikliosios medžiagos iš karto slopina tarpląstelinę RNazę, todėl RNR lieka nepažeista.Tai reiškia, kad kultivuojamos ląstelės lengvai ir visiškai susiliečia su lizatu, todėl jų RNR nėra lengvai skaidoma;kita vertus, audinyje esanti RNR lengvai suyra, nes audinyje esančioms ląstelėms nėra lengva greitai susisiekti su lizatu.dėl pakankamo kontakto.Taigi,Darant prielaidą, kad yra būdas paversti audinį viena ląstele, tuo pačiu slopinant RNR aktyvumą, skilimo problema gali būti visiškai išspręsta.

Veiksmingiausias toks būdas yra malimas skystu azotu.Tačiau skysto azoto malimo būdas yra labai varginantis, ypač kai mėginių skaičius yra didelis.Taip atsirado kitas geriausias dalykas: homogenizatorius.ThehomogenizatoriusŠis metodas nenagrinėja klausimo, kaip RNazės aktyvumas slopinamas prieš ląstelėms susiliečiant su lizatu, o meldžiasi, kad audinių ardymo greitis būtų greitesnis nei greitis, kuriuo tarpląstelinė RNazė skaido RN.

Elektrinio homogenizatoriaus poveikis yra geresnis,ir stiklo homogenizatoriaus poveikis yra prastas, tačiau apskritai homogenizatoriaus metodas negali užkirsti kelio skilimo reiškiniui.Todėl, jei ekstrahavimas pablogėja, šlifavimui skystu azotu reikia naudoti originalų elektrinį homogenizatorių;originalus stiklo homogenizatorius turi būti pakeistas į elektrinį homogenizatorių arba tiesiogiai sumaltas skystu azotu.Problema yra beveik 100% įmanoma.išsispręsti.

Priemaišų likučių problema, turinti įtakos tolesniems eksperimentams, turi daugiau skirtingų priežasčių nei skilimas, o sprendimai atitinkamai skiriasi.Apibendrinant,jei audinyje yra skilimo arba liekamųjų priemaišų, turi būti optimizuotas konkrečios eksperimentinės medžiagos ekstrahavimo metodas/reagentas.Jums nereikia naudoti savo brangių mėginių optimizavimui: galite nusipirkti smulkių gyvūnų, pavyzdžiui, žuvį / vištieną, iš turgaus, paimti atitinkamą dalį medžiagos RNR ekstrahavimui, o kitą dalį baltymų ekstrahavimui – sumalti burna, skrandžiu ir žarnomis Ekstraktas.

Išskirtos RNR tikslinė RNR naudojama skirtingiems tolesniems eksperimentams, o jos kokybės reikalavimai yra skirtingi

cDNR bibliotekos konstravimui reikalingas RNR vientisumas be fermentų reakcijos inhibitorių likučių;Šiaurės reikalauja didesnio RNR vientisumo ir mažesnių reikalavimų fermentų reakcijos inhibitorių likučiams;RT-PGR nereikalauja per didelio RNR vientisumo,bet slopina fermentų reakcijas.Likučių reikalavimai yra griežti.Įvestis nustato išėjimą;kiekvieną kartą, kai siekiama gauti aukščiausio grynumo RNR, tai kainuos žmonėms ir pinigus.

Mėginių surinkimas/saugojimas

Degradaciją įtakojantys veiksniai Mėginiui palikus gyvą kūną/arba pradinę augimo aplinką, mėginyje esantys endogeniniai fermentai pradės skaidyti RNR,o skilimo greitis yra susijęs su endogeninių fermentų kiekiu ir temperatūra.Tradiciškai yra tik du būdai visiškai slopinti endogeninį fermentų aktyvumą: nedelsiant įpilti lizato ir kruopščiai bei greitai homogenizuoti;supjaustykite mažais gabalėliais ir iš karto užšaldykite skystame azote.Abu metodai reikalauja greito veikimo.Pastarasis tinka visiems mėginiams, o pirmasis – tik audiniams, kuriuose yra mažai ląstelių ir endogeninių fermentų ir kuriuos lengviau homogenizuoti.Konkrečiai, augalų audiniai, kepenys, užkrūčio liauka, kasa, blužnis, smegenys, riebalai, raumenų audiniai ir kt. prieš tęsiant geriausia užšaldyti skystu azotu.

Mėginių suskaidymas ir homogenizavimas

Degradaciją ir derlių įtakojantys veiksniai Mėginio suskaidymas yrakruopščiam homogenizavimui, kuris skirtas visiškam ir visiškam RNR atpalaidavimui.Ląstelės gali būti tiesiogiai homogenizuojamos, nesulaužant.Audinius homogenizuoti galima tik sulaužius.Prieš homogenizuojant mieles ir bakterijas reikia suskaidyti atitinkamais fermentais.Audiniai su mažesniu endogeninių fermentų kiekiu ir lengvesniu homogenizavimu gali būti susmulkinti ir homogenizuoti vienu metu lizate homogenizatoriumi;augaliniai audiniai, kepenys, užkrūčio liauka, kasa, blužnis, smegenys, riebalai, raumenų audinys ir kiti mėginiai, juose yra daug endogeninių fermentų arba jie nėra lengvai homogenizuojami,todėl audinių ardymas ir homogenizavimas turi būti atliekami atskirai.Patikimiausias ir produktyviausias skaldymo būdas yra malimas skystu azotu, o patikimiausias homogenizavimo būdas – elektrinio homogenizatoriaus naudojimas.Ypatinga pastaba apie malimą skystu azotu: viso malimo proceso metu mėginio negalima atitirpti, nes užšalus labiau veikia endogeniniai fermentai.

Lizato pasirinkimas

Įtaka eksploatavimo patogumui ir liekamųjų endogeninių priemaišų veiksniams Dažniausiai naudojami lizės tirpalai gali beveik slopinti RNazės aktyvumą.Todėl svarbiausias dalykas renkantis lizės tirpalą yra apsvarstyti kartu su valymo metodu.Yra viena išimtis:Mėginiams, kuriuose yra daug endogeninių fermentų, rekomenduojama naudoti lizatą, kuriame yra fenolio, kad padidėtų gebėjimas inaktyvuoti endogeninius fermentus.

Valymo metodo pasirinkimas

Veiksniai, turintys įtakos likutinėms endogeninėms priemaišoms, ekstrahavimo greičiui Švarių mėginių, tokių kaip ląstelės, patenkinamus rezultatus galima gauti naudojant beveik bet kurį turimą gryninimo metodą.Tačiau daugeliui kitų mėginių, ypač tų, kuriuose yra daug priemaišų, pvz., augalų, kepenų, bakterijų ir kt., labai svarbu pasirinkti tinkamą valymo metodą.Kolonėlės išcentrinis valymo metodas pasižymi dideliu ekstrahavimo greičiu ir gali veiksmingai pašalinti priemaišas, kurios turi įtakos vėlesnei fermentinei RNR reakcijai, tačiau jis yra brangus (Foregene gali pasiūlyti ekonomiškus rinkinius, daugiau informacijos spustelėkitečia);Naudojant ekonomiškus ir klasikinius valymo metodus, tokius kaip LiCl nusodinimas, taip pat galima gauti patenkinamų rezultatų, tačiau veikimo laikas yra ilgas..

„Trys disciplinos ir aštuoni dalykai“, skirti RNR ekstrahavimui

1 disciplina:Padarykite galą egzogeninių fermentų užteršimui.

1 pastaba:Griežtai dėvėkite kaukes ir pirštines.

Užrašas 2:Eksperimente naudojami centrifugos mėgintuvėliai, antgaliai, pipetės strypai, elektroforezės bakai ir eksperimentiniai stendai turi būti kruopščiai išmesti.

3 pastaba:Eksperimente dalyvaujantys reagentai / tirpalai, ypač vanduo, turi būti be RNazės.

2 disciplina:Blokuoti endogeninių fermentų aktyvumą

4 pastaba:Pasirinkite tinkamą homogenizacijos metodą.

5 pastaba:Pasirinkite tinkamą lizatą.

6 pastaba:Kontroliuokite pradinį mėginio kiekį.

3 disciplina:Paaiškinkite savo ištraukimo tikslą

7 pastaba:Bet kuriai lizato sistemai artėjant prie didžiausio pradinio mėginio kiekio, ekstrahavimo sėkmės rodiklis smarkiai sumažėja.

8 pastaba:Vienintelis ekonominis sėkmingo RNR ekstrahavimo kriterijus yra vėlesnių eksperimentų sėkmė, o ne derlius.

10 geriausių RNazės užteršimo šaltinių

1. Pirštai yra pirmasis egzogeninių fermentų šaltinis, todėl pirštines reikia mūvėti ir dažnai keisti.Be to, būtina dėvėti kaukes, nes kvėpavimas taip pat yra svarbus fermentų šaltinis.Papildomas pirštinių kaukės dėvėjimo pranašumas yra apsaugoti eksperimentuotoją.

2. Pipečių antgaliai, centrifugos mėgintuvėliai, pipetės – RNazės negalima inaktyvuoti vien sterilizuojant, todėl pipetės antgaliai ir centrifugos mėgintuvėliai turi būti apdoroti DEPC, net jei jie pažymėti kaip apdoroti DEPC.Geriausia naudoti specialios paskirties pipetę, prieš naudojimą nuvalykite ją 75% alkoholio vatos tamponu, ypač lazdele;be to, būtinai nenaudokite galvos nuėmiklio.

3. Vanduo/buferis neturi būti užterštas Rnaze.

4. Bent bandymo lentelę reikia nuvalyti 75 % alkoholio turinčiais vatos kamuoliukais.

5. Endogeninė RNazė Visuose audiniuose yra endogeninių fermentų, todėl greitas audinių užšaldymas skystu azotu yra geriausias būdas sumažinti degradaciją.Skysto azoto laikymo/malimo būdas išties nepatogus, tačiau tai vienintelis būdas audiniams, kuriuose yra daug endogeninių fermentų.

6. RNR mėginiai RNR ekstrahavimo produktuose gali būti užteršimo Rnaze pėdsakų.

7. Plazmidės ekstrahavimas Plazmidės ekstrahavimo metu RNR suskaidymui dažnai naudojama Rnazė, o likusią Rnazę reikia suvirškinti proteinaze K ir ekstrahuoti PCI.

8. RNR saugojimas Net jei jis laikomas žemoje temperatūroje, nedideli RNazės kiekiai sukels RNR degradaciją.Geriausias sprendimas ilgalaikiam RNR išsaugojimui yra druskos/alkoholio suspensija, nes esant žemai temperatūrai alkoholis slopina visą fermentinį aktyvumą.

9. Kai katijonuose (Ca, Mg) yra šių jonų, kaitinant 80C temperatūroje 5 minutes, RNR bus suskaldyta, taigi, jei RNR reikia kaitinti, konservavimo tirpale turi būti kompleksonas (1mM natrio citratas, pH 6,4).

10. Vėlesniuose eksperimentuose naudojami fermentai gali būti užteršti RNaze.

10 RNR ekstrahavimo patarimų

1: Greitai užkirskite kelią RNazės aktyvumui.Po paėmimo mėginiai greitai užšaldomi, o RNazė inaktyvuojama greitai veikiant lizės metu.

2: Pasirinkite tinkamą ekstrahavimo metodą audiniams, kuriuose yra daug ribozimų, o riebaliniam audiniui geriausia naudoti metodą, kurio sudėtyje yra fenolio.

3: Numatymo kokybei reikalingas Northern, cDNR bibliotekos statybai reikalingas didelis vientisumas, o RT-PGR ir RPA (ribonukleazės apsaugos tyrimas) nereikalauja didelio vientisumo.RT-PGR reikalauja didelio grynumo (fermento inhibitorių likučių).

4: Kruopštus homogenizavimas yra raktas į geresnį derlių ir sumažinant degradaciją.

5: Patikrinkite RNR elektroforezės aptikimo vientisumą, 28S: 18S = 2: 1 yra pilnas ženklas, 1: 1 taip pat priimtinas daugeliui eksperimentų.

6: DNR pašalinimas RT-PGR, matricos analizei DNR pašalinti geriausia naudoti Dnazę I.

7: Sumažinkite egzogeninių fermentų užterštumą – fermentai negali būti importuojami iš išorės.

8: Koncentruojant mažos koncentracijos nukleino rūgštį, reikia pridėti bendro nusodinimo reagento.Tačiau siekiant išvengti koprecipitanto, kuriame yra fermentų, ir DNR užteršimo.

9: Kruopščiai ištirpinkite RNR, jei reikia, pakaitinkite 65C temperatūroje 5 minutes.

tinkamas saugojimo būdas

–20C temperatūroje galima laikyti trumpai, o –80C – ilgai.Pirmasis žingsnis gerinant RNR derlių yra suvokimas, kad RNR kiekis skirtinguose mėginiuose labai skiriasi.Didelis kiekis (2–4 ug/mg), pvz., kepenys, kasa, širdis, vidutinis kiekis (0,05–2 ug/mg), pvz., smegenys, embrionas, inkstai, plaučiai, užkrūčio liauka, kiaušidės, mažas kiekis (<0,05 ug/mg) mg), pvz., šlapimo pūslė, kaulai, riebalai.

1: Lizuokite ląsteles, kad išlaisvintumėte RN – jei RNR neišsiskiria, derlius sumažės.Elektrinis homogenizavimas veikia geriau nei kiti homogenizacijos metodai, tačiau gali prireikti jį derinti su kitais metodais, tokiais kaip skysto azoto trynimas, fermentinis skaidymas (lizocimas/litikazė).

2: ekstrahavimo metodo optimizavimas.Didžiausios fenolio pagrindu pagamintų metodų problemos yra nepilnas stratifikacija ir dalinis RNR praradimas (supernatantas negali būti visiškai pašalintas).Nepilna stratifikacija atsiranda dėl didelio nukleorūgščių ir baltymų kiekio, kurį galima išspręsti padidinus naudojamo lizato kiekį arba sumažinus mėginio kiekį.Į riebalinį audinį buvo pridėtas chloroformo ekstrahavimo etapas.RNR praradimą galima sumažinti pumpuojant atgal arba pašalinant organinį sluoksnį ir centrifuguojant.Didžiausia kolonėlės centrifugavimo metodų problema yra mėginio perteklius.

Klasikiniai ištraukimo patarimai

1. Fenolio gryninimas: Įpilkite vienodo tūrio 1:1 fenolio/chloroformo ir energingai maišykite 1-2 minutes.Centrifuguokite dideliu greičiu 2 minutes.Atsargiai pašalinkite supernatantą (80-90%).Niekada nepasiekti vidurinio sluoksnio.Vienodą tūrį reakcijos tirpalo galima įpilti į fenolį/chloroformą ir pašalinti supernatantą.Du supernatantai gali būti sumaišyti kartu, kad nusodintų nukleino rūgštis, kad būtų pagerintas derlius.Maišydami nebūkite per švelnūs ir nesistenkite pašalinti viso supernatanto.

2. Plovimas 70-80 % etanoliu: skalbimo metu nukleino rūgštis turi būti suspenduota, kad būtų nuplaunamos druskos likučiai.Tuo pačiu metu, iš karto nupylę etanolį, keletą sekundžių centrifuguokite dideliu greičiu, o tada pipete pašalinkite etanolio likučius.Ištirpinkite po 5-10 minučių pastovėjimo kambario temperatūroje.

11. Specialiųjų organizacijų ištraukimas

1. Skaidulinis audinys: RNR išskyrimo iš pluoštinio audinio, pvz., širdies/skeleto raumenų, raktas yra visiškai suardyti audinį.Šie audiniai turi mažą ląstelių tankį, todėl RNR kiekis audinio masės vienete yra mažas, todėl geriausia naudoti kuo daugiau pradinio kiekio.Būtinai gerai sumalkite audinį užšalimo sąlygomis.

2. Audiniai su dideliu baltymų/riebalų kiekiu: didelis smegenų/augalinių riebalų kiekis.Po PCI ekstrahavimo supernatante yra baltų flokulų.Supernatantas turi būti iš naujo ekstrahuojamas chloroformu.

3. Audiniai, kuriuose yra daug nukleorūgščių / ribozimų: blužnyje / užkrūčio liaukoje yra daug nukleorūgščių ir ribozimų.Šlifuojant audinį užšalimo sąlygomis, po to greitai homogenizuojant, galima veiksmingai inaktyvuoti ribozimus.Tačiau jei lizatas yra per klampus (dėl didelio nukleorūgščių kiekio), PCI ekstrahavimas negalės efektyviai stratifikuotis;Pridėjus daugiau lizato, ši problema gali būti išspręsta.Keli PCI ekstraktai gali pašalinti daugiau DNR likučių.Jei iškart įpylus alkoholio susidaro baltos nuosėdos, tai rodo DNR užteršimą.Pakartotinis ekstrahavimas rūgštiniu PCI po ištirpinimo gali pašalinti DNR užteršimą.

4. Augalinis audinys: Augalinis audinys yra sudėtingesnis nei gyvūnų audinys.Paprastai augalai sumalami skysto azoto sąlygomis, todėl RNR skaidymas endogeniniais fermentais yra nedažnas.Jei skilimo problema neišspręsta, ją beveik neabejotinai sukelia mėginyje esančios priemaišos.Daugelyje augalų esančios priemaišos sukels likučius, o likučių atsiradimo priežastis dažnai yra ta, kad šios priemaišos turi tam tikrų panašumų su RNR: jūs nusodinate, o aš nusodinu, o jūs adsorbuosite, o aš adsorbuosiu.Šios savybės lemia, kad jie yra labai stiprūs fermentų inhibitoriai.

Šiuo metu komerciniai RNR ekstrahavimo reagentai gali būti pritaikyti beveik visiems gyvūnų audiniams su nedideliais koregavimais, tačiau yra nedaug komercinių RNR ekstrahavimo reagentų, kurie gali būti tinkami daugumai augalų audinių.Laimei, Foregene gali suteikti specialiųaugalų RNR ekstrahavimo rinkiniai, mes turimeAugalų bendros RNR izoliacijos rinkinys, Plant Total RNR izoliacijos rinkinys Plus.Pastarasis yra specialiai sukurtas augalams, turintiems daug polisacharidų ir polifenolių.Laboratorijos naudotojų atsiliepimai apie RNR ekstrahavimą yra ypač geri.

12. Mėginio užšaldymo ir atšildymo poveikis Užšaldytas mėginys gali būti didesnis, todėl prieš naudojant RNR ekstrakcijai jį reikia supjaustyti.Pjovimo metu mėginiai linkę išsilydyti (galbūt iš dalies).Prieš išskiriant RNR, gali tekti pasverti užšaldytus mėginius, o šio proceso metu jie tikrai atitirps.Kartais mėginys atitirpsta ir skysto azoto malimo proceso metu;arba užšaldytas mėginys yra tiesiogiai įpilamas į lizatą be skysto azoto malimo, o atšildymas tikrai įvyks prieš visišką homogenizaciją.Eksperimentai parodė, kad užšaldytas audinys yra labiau linkęs į RNR skaidymą atšildymo metu nei šviežias.Tikėtina priežastis: užšalimo-atšildymo procesas suardo ląstelės struktūras, todėl endogeniniams fermentams lengviau tiesiogiai liestis su RNR.

13. RNR kokybės vertinimas Paprastai RNR vientisumui įvertinti naudojama elektroforezė, o RNR grynumui – A260/A280.Teoriškai nepažeistos RNR santykis yra 28S:18S = 2,7:1, o dauguma duomenų pabrėžia 28S:18S = 2:1 santykį.Faktas yra tas, kad beveik jokios RNR, išskirtos iš mėginių, išskyrus ląsteles, santykis yra 2:1 (tai buvo gauta naudojant Agilent Bioanalyzer).

RNR elektroforezės rezultatus veikia daugelis veiksnių, įskaitant antrinę struktūrą, elektroforezės sąlygas, mėginio apkrovą, EB prisotinimo laipsnį ir kt. RNR aptikti naudokite natūralią elektroforezę ir naudokite DNR žymeklį kaip kontrolę.Jei 28S esant 2kb ir 18S 0,9kb yra aiškūs, o 28S: 18S > 1, vientisumas gali atitikti daugumos vėlesnių eksperimentų reikalavimus.

A260/A280 yra indikatorius, sukėlęs daug painiavos.Pirmiausia reikia išsiaiškinti pirminę šio rodiklio reikšmę nukleino rūgštims: gryna RNR, jos A260/280 = apie 2,0.Gryna RNR yra „priežastis“, o A260/A280 = 2 yra „pasekmė“.Dabar visi naudoja A260/A280 kaip „priežastį“, manydami, kad „jei A260/A280 = 2, vadinasi, RNR yra gryna“, o tai natūraliai sukelia painiavą.

Jei jus domina, į savo RNR mėginį galite įpilti šiek tiek reagento, kuris dažnai naudojamas ekstrahuojant, pvz., fenolio, guanidino izotiocianato, PEG ir kt., ir tada išmatuoti A260/A280 santykį.Realybė tokia, kad daugelis RNR ekstrakcijai naudojamų reagentų, taip pat daugelis mėginyje esančių priemaišų, sugeria maždaug A260 ir A280, paveikdami A260/A280.

Šiuo metu labiausiai pamokantis būdas yra nuskaityti RNR mėginius 200–300 nm diapazone.Grynos RNR kreivė turi šias charakteristikas: kreivė yra lygi, A230 ir A260 yra du vingio taškai, A300 yra artimas 0, A260/A280 = apie 2,0 ir A260/A230 = apie 2,0.Jei skenavimo duomenų nėra, taip pat reikia nustatyti A260/A230 santykį, nes šis santykis yra jautresnis visų priemaišų, turinčių įtakos fermentinei reakcijai, pernešimui.Atsižvelkite į prietaiso linijinį diapazoną (0,1–0,5 A260).

Yra dar du naudingi reiškiniai: matuojant A260/A280 vandenyje santykis bus maždaug 0,3 mažesnis;10 mM EDTA išmatuotas santykis yra maždaug 0,2 didesnis nei išmatuotas 1 mM EDTA.

Susiję produktai:

„China Plant Total RNA Isolation Kit“ gamintojas ir tiekėjas |Foregene (foreivd.com)

RNR izoliacijos serija Tiekėjai ir gamykla |Kinijos RNR izoliacijos serijos gamintojai (foreivd.com)

RNR izoliavimo serija – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)