1. Nustatykite RNR tirpalo absorbciją
Absorbcija ties 280, 320, 230 ir 260 nm atitinka atitinkamai nukleino rūgšties, fono (tirpalo drumstumo), druskos koncentracijos ir organinių medžiagų, pvz., baltymų, vertes.Paprastai žiūrėkite tik į OD260/OD280 (santykis, R).Kai 1,8–2,0, manome, kad baltymų ar kitų organinių medžiagų užteršimas RNR gali būti toleruojamas, tačiau reikia pažymėti, kad kai Tris naudojamas kaip buferis absorbcijai nustatyti, R reikšmė gali būti didesnė nei 2 (paprastai ji turėtų būti <2,2).Kai R<1,8, baltymų ar kitų organinių medžiagų užterštumas tirpale yra akivaizdesnis, o RNR likimas gali būti nustatomas pagal poreikius.Kai R>2,2, tai reiškia, kad RNR buvo hidrolizuota į vieną nukleorūgštį.
2.RNR elektroforezinis modelis
Paprastai denatūruojantis gelis naudojamas RNR elektroforezei, tačiau jei jis skirtas tik RNR kokybei nustatyti, denatūruojantis gelis nebūtinas, galima naudoti įprastą agarozės gelį.Elektroforezės tikslas – nustatyti 28S ir 18S juostų vientisumą ir jų santykį arba mRNR tepinėlio vientisumą.Paprastai, jei 28S ir 18S juostos yra ryškios, aiškios ir aštrios (juostų kraštai yra skaidrūs), o 28S ryškumas yra daugiau nei du kartus didesnis nei 18S juostos, manome, kad RNR kokybė yra gera.
Pirmiau pateikti du metodai, kuriuos dažniausiai naudojame, tačiau nė vienas iš šių dviejų metodų negali aiškiai pasakyti, ar RNR tirpale yra likutinės RNazės.Jei tirpale yra labai mažas RNazės kiekis, mums sunku jį aptikti aukščiau nurodytu metodu, tačiau dauguma vėlesnių fermentinių reakcijų vyksta aukštesnėje nei 37 laipsnių temperatūroje ir ilgą laiką.Tokiu būdu, jei RNR tirpale yra labai mažas RNazės kiekis, tada bus labai tinkama aplinka ir laikas atlikti savo vaidmenį tolesniuose eksperimentuose, ir, žinoma, eksperimentas šiuo metu bus šaltas.Žemiau pristatome metodą, kuris gali patvirtinti, ar RNR tirpale yra likutinės RNazės.
3. Šilumos išsaugojimo bandymas
Atsižvelgdami į mėginio koncentraciją, iš RNR tirpalo paimkite dvi 1000 ng RNR ir įpilkite į 0,5 ml centrifugos mėgintuvėlį, papildykite pH 7,0 Tris buferiu, kad bendras tūris būtų 10 ul, tada uždarykite mėgintuvėlio dangtelį.Vieną iš jų įdėkite į pastovios temperatūros 70°C vandens vonią ir palaikykite šiltai 1 val.Kita dalis buvo laikoma -20°C šaldytuve 1 val.Pasibaigus laikui, išimkite du mėginius elektroforezei.Baigę elektroforezę, palyginkite abiejų elektroforezės juostas.Jei abiejų juostos yra nuoseklios arba neturi reikšmingo skirtumo (žinoma, jų juostos taip pat atitinka 2 metodo sąlygas), tai reiškia, kad RNR tirpale nėra likutinės RNazės užterštumo, o RNR kokybė yra labai gera.Priešingai, jei mėginys, inkubuotas 70 ° C temperatūroje, akivaizdžiai suyra, tai rodo, kad RNR tirpale yra užteršimas Rnaze.
2 Eksperimentiniai RNR ekstrahavimo metodai ir metodai
Problemos, su kuriomis dažnai susiduriame ekstrahuodami RNR, yra šios: (1) RNR išeiga yra maža;(2) RNR yra labai užteršta druskomis;(3) RNR yra labai užteršta organiniais tirpikliais;(4) mėginio degradacija ir kitos problemos
1. Dažniausiai naudojami bendros RNR ekstrahavimo reagentai
Guanidino izotiocianato metodas ir Trizol metodas yra dažniausiai naudojami bendrosios RNR išgavimo iš gyvūnų audinių ir gyvūnų ląstelių metodai.Jis ypač tinka mažiems mėginiams ir audiniams, kuriuos ypač sunku išgauti, pavyzdžiui, visos RNR ekstrahavimui iš triušio odos ir gyvūnų jungiamojo audinio;be to, Trizol, kaip bendrosios paskirties lizės reagentas, taip pat gali būti naudojamas augalų audiniams, bakterijoms, grybeliams ir kitiems audiniams ekstrahuoti.Augalų audiniams, kuriuose yra polisacharidų ir polifenolių, pvz., Camellia oleifera, arbatos lapams, rapsams ir kt., CTAB metodas taip pat gali būti naudojamas bendrai RNR išgauti.
Kaip įprastas metodas, dviejų kolonėlių metodas taip pat yra labai populiarus dėl normalios temperatūros veikimo, nereikia pridėti RNazės ir saugumo – ekstrahavimui nereikia chloroformo, fenolių ir kitų organinių reagentų.(rekomenduojami produktai )
2. Suminės RNR išskyrimas iš gyvūnų audinių
(1) Stenkitės pasirinkti šviežią servetėlę, jei ji nėra šviežia (geriausia per tris mėnesius - 80 ℃ šaldytuve arba sušaldyta skystame azote. Pjaudami audinį nepjaustykite tiesiai kambario temperatūroje, būtinai dėkite ant ledo dėžutės, stenkitės vengti pakartotinio užšalimo ir atšildymo.
(2) Švariomis žirklėmis ir pincetu nupjaukite nedidelį audinio gabalėlį, pjaustydami mėginį pabandykite perpjauti centrinę audinio dalį arba pirmiausia nupjaukite didelį audinio gabalėlį nuo vidurio, o tada nupjaukite mėginį šviežio pjūvio vietoje.Pašalintas audinys turi būti visiškai susmulkintas, susmulkintą audinį sudėkite į EP mėgintuvėlį be RNazės, įpilkite lizato, susmulkintą audinį reikia visiškai paveikti lizatu ir paruošti homogenizacijai.
(3) Normaliems audiniams homogenizuoti pasirinkite mung pupelės dydžio audinius (30–60 mg).Jei audiniuose yra daug baltymų, riebalų arba tankių pluoštinių audinių, tokių kaip kepenys, atitinkamai padidinkite arba sumažinkite nupjautų audinių kiekį (nebūtina) Pasirinkite 10–20 mg).
(4) Jei ekstrahuojami žuvies raumenys, krevečių mėsa, medūzos ir kiti audiniai, kuriuose yra daug vandens, mėginio tūris turėtų būti atitinkamai padidintas (rekomenduojama 100–200 mg).
(5) Jei sąlygos leidžia, gyvūno audinys gali būti tiesiogiai ekstrahuojamas po to, kai buvo homogenizuotas didelio pralaidumo audinių homogenizatoriumi, jei tokios įrangos nėra.
(6) RNR, gauta po galutinio ekstrahavimo, turi būti nedelsiant dedama ant ledo dėžutės, kad būtų sumažintas RNR skilimas.
3. Gyvūnų ląstelių RNR ekstrahavimas
(1) Suspensijos ląstelės: centrifuguokite tiesiogiai ir išmeskite terpę, 1–2 kartus plaukite steriliu PBS, tada suspenduokite atitinkamu kiekiu PBS ir tada pridėkite lizato lizei.Nepilkite lizato tiesiai į nusodintas ląsteles visiškai išleidę skystį.Dėl to histono paketas, išsiskiriantis po lizuotų ląstelių išoriniame sluoksnyje, prilips prie nusodintų ląstelių išorės, taip apribodamas granulės viduje esančių ląstelių kontaktą su lizatu., dėl ko vyksta nepilna ląstelių lizė ir sumažėja RNR išeiga.
(2) Ląstelės, kurios yra pusiau sulipusios arba nėra tvirtai prilipusios: išmetę terpę, plaukite PBS 1–2 kartus, tada tiesiogiai sugerkite atitinkamą kiekį PBS ir išpūskite kultivavimo lėkštelę pipete arba pistoletu, kad išpūstumėte ląsteles, ir perkelkite jas į ląsteles, kuriose nėra RNR.Įpilkite lizatą į fermento EP mėgintuvėlį ekstrahavimui.
(3) Prilipusios ląstelės: pirmiausia reikia suvirškinti tripsinu, tada surinkti į EP mėgintuvėlius, kuriuose nėra RNazės, centrifuguoti, kad būtų pašalintas supernatantas, 1–2 kartus plauti PBS, kad būtų pašalintas tripsino perteklius, ir resuspenduoti atitinkamu kiekiu PBS. Tada pereikite prie ekstrahavimo etapo.
4. Augalų RNR ekstrahavimas
Augalų audiniai turi daug fenolinių junginių arba daug polisacharidų, juose yra kai kurių nenustatytų antrinių metabolitų arba jie turi didelį RNazės aktyvumą.Šios medžiagos glaudžiai susijungia su RNR po ląstelių lizės, kad susidarytų netirpūs kompleksai arba koloidinės nuosėdos, kurias sunku pašalinti.Todėl kai ekstrahuojame augalų audinius, turime pasirinkti rinkinį augalams.Rinkinyje esantis lizatas gali veiksmingai išspręsti lengvo polifenolių oksidacijos ir polisacharidų junginių bei nukleorūgščių atskyrimo problemas.
(Polisacharido polifenolio augalų RNR ekstrahavimui rekomenduojami produktai:
(1) Augalo žievelė, minkštimas, sėklos, lapai ir kt. turi būti visiškai sumalti skiedinyje.Šlifavimo proceso metu skystas azotas turi būti laiku papildytas, kad mėginys neištirptų.Sumaltą mėginį reikia greitai įpilti į lizatą ir sukratyti, kad būtų išvengta RNR skilimo.
(2) Jei mėginiai, kuriuose gausu skaidulų, pavyzdžiui, ryžių ir kviečių lapai, ekstrahavimo kiekis turėtų būti atitinkamai sumažintas, nes priešingu atveju audiniai šlifuojami ir lizuojami nebus baigti, todėl ekstrahuotos RNR bus mažai.
(3) Daug vandens turinčių augalų audinių, pvz., granatų, arbūzų, persikų vaisių ir kt., mėginio dydis turėtų būti atitinkamai padidintas (100–200 mg neprivaloma).
(4) Augalų audiniams, pvz., augalų lapams, šakniastiebiams, kietiems vaisiams ir kitoms medžiagoms, paprastai rekomenduojama naudoti skystą azotą, kad kruopščiai sumaišytumėte sudedamąsias dalis skiedinyje, o tada pereikite prie ekstrahavimo etapo.Įprasti audinių homogenizatoriai gali būti neveiksmingi homogenizuojant augalų audinius ir paprastai nerekomenduojami.
5. Atsargumo priemonės RNR ekstrahavimui
(1) Audinių mėginiai turi būti kuo šviežesni, kad būtų išvengta pakartotinio užšalimo ir atšildymo.
(2) Ekstrahavimo metu audinys turi būti visiškai sumaltas, o audinio kiekis neturi būti per mažas, jau nekalbant apie per daug.
(3) Įpylus lizato, reikia skirti pakankamai inkubacijos laiko, kad mėginys visiškai lizuotų.
(4) Ekstrahavimui naudojant Trizol metodą, supernatanto absorbavimo po stratifikacijos principas yra „geriausia įkvėpti mažiau, nei įkvėpti daugiau“ ir neturi ekstrahuoti į vidurinį sluoksnį, nes priešingu atveju bus rimtai užteršta genomo DNR.
(5) Plaunant plovimo skystis turi visiškai prasiskverbti aplink vamzdelio sienelę, kad būtų užtikrintas kruopštus plovimas.
(6) Taikant kolonėlės ekstrahavimo metodą, adsorbcinę kolonėlę reikia ne tik atskirti po plovimo, bet ir padėti ant itin švaraus stendo ir 5–10 minučių pūsti, kad organinis tirpiklis visiškai išgaruotų iki sausumo.
(7) Paskutinio kolonėlės metodo eliuavimo metu, įpylus DEPC vandens, jį reikia inkubuoti 3–5 minutes arba DEPC vandenį iš anksto pašildyti iki 60°C, kad padidėtų eliuavimo išeiga.Taikant tradicinį Trizol skilimo ir nusodinimo izopropanoliu metodą, galutinė RNR ištirpinama DEPC vandenyje, todėl reikia skirti tinkamą laiką ištirpimui, o centrifugos mėgintuvėlio dugnas turi būti nuolat pučiamas pipetės antgaliu.
3 T3 Mažos RNR koncentracijos / prastos kokybės priežastys ir sprendimai
1. Derlius per mažas
Išskirto mėginio yra per mažai, viso jo nepakanka arba ištraukto per daug, o lizė nebaigta;Ekstrahavimui turi būti naudojamas tinkamos kokybės audinys arba ląstelės, mėginio išankstinis apdorojimas turi būti atliktas gerai, o lizė turi būti pakankama.
2. Genomo liekanos
Ekstrahuojant Trizol metodu, kai po sluoksniavimo supernatantas įsiurbiamas į vidurinį sluoksnį, bus sukeltas rimtas genomo užterštumas;sluoksniuojant reikia būti ypač atsargiems, kad neįsiurbtų į vidurinį sluoksnį.Jei ekstrahavimui naudojamas kolonėlės metodas, ekstrahavimui galima pasirinkti rinkinį, kuriame yra DNazė I.Ant membranos adsorbuota nukleorūgštis tiesiogiai suardoma DNaze I, kuri gali labai sumažinti DNR liekanas.
3. RNR degradacija
Tai gali būti paties ekstrahuoto mėginio skilimas arba skilimas, atsiradęs ekstrahavimo proceso metu;RNR ekstrahavimui pagal galimybes reikia naudoti šviežius mėginius, o surinktus mėginius laiku laikyti skystame azote arba -80°C šaldytuve, vengti pakartotinio užšaldymo ir atšildymo.RNR ekstrahavimo procese turėtų būti naudojami antgaliai, kuriuose nėra RNazės/DNazės, centrifuginiai mėgintuvėliai ir kitos medžiagos.Ištraukimo procesas turėtų būti kuo greitesnis.Išskirta RNR turi būti dedama ant ledo dėžutės ir laikoma -80 laipsnių temperatūroje.Jei išskirtą RNR reikia aptikti gelio elektroforezės būdu, iš karto po ekstrahavimo reikia atlikti elektroforezę, o elektroforezės buferį pakeisti naujai paruoštu.
4. Druskos ir organinių tirpiklių likučiai
Ekstrahavimo reagentuose yra fenolio ir guanidino druskų, o plovimo tirpale yra etanolio.Ekstrahavimo proceso metu lizatas nebuvo visiškai absorbuojamas ir išmestas, o plovimo tirpalas nebuvo visiškai išdžiovintas.Likusios druskos ir organiniai tirpikliai kenkia vėlesnei atvirkštinei transkripcijai ir PGR.Skirtingi slopinimo laipsniai, todėl ekstrahavimo proceso metu audinių lizatas turi būti visiškai pašalintas, o plovimas turi būti pakankamas, kad būtų galima nuplauti aplinkines vamzdelio sieneles.Be to, vamzdis ištuštinamas ir išpučiamas yra būtinas žingsnis, kuris dar labiau sumažins organinių medžiagų likučius.
Norėdami gauti daugiau informacijos apie RNR ekstrahavimą, apsilankykite mūsų svetainėje:
Daugiau informacijos rasite www.foreivd.com.
Paskelbimo laikas: 2022-01-01
