Esame patyrę gamintojas.Laimėjęs daugumą svarbiausių savo rinkos sertifikatų, skirtų „China High Sensitivity One-Step Probe Rt.QvntV2 rinkinys, kokybė yra gamyklos gyvenimas, dėmesys klientų paklausai yra įmonės išlikimo ir plėtros šaltinis, Mes laikomės sąžiningumo ir sąžiningo darbo požiūrio, laukiame jūsų atvykimo!
Esame patyrę gamintojas.Laimėti daugumą svarbiausių savo rinkos sertifikatųKinijos Taq DNR polimerazė, Qvnt, Mūsų įmonė žada: priimtinas kainas, trumpą gamybos laiką ir patenkinamą aptarnavimą po pardavimo, taip pat kviečiame apsilankyti mūsų gamykloje bet kuriuo norimu metu.Linkime, kad dabar turėtume malonų ir ilgalaikį verslą kartu!!!

Aprašymai

Šiame rinkinyje naudojama unikali lizės buferio sistema, kuri gali greitai atpalaiduoti RNR iš kultivuotų ląstelių mėginių RT-qPCR reakcijoms, taip pašalinant daug laiko reikalaujantį ir daug pastangų reikalaujantį RNR valymo procesą.RNR šabloną galima gauti vos per 7 minutes.Komplekte esantys 5×Direct RT Mix ir 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagentai gali greitai ir efektyviai gauti kiekybinius PGR rezultatus realiuoju laiku.

5×Direct RT Mix ir 2×Direct qPCR Mix-SYBR turi stiprią inhibitorių toleranciją, o mėginių lizatas gali būti tiesiogiai naudojamas kaip RT-qPCR šablonas.Šiame rinkinyje yra unikali RNR didelio afiniteto Foregene atvirkštinė transkriptazė ir Hot D-Taq DNR polimerazė, dNTP, MgCl.₂, reakcijos buferis, PGR optimizatorius ir stabilizatorius.

Specifikacijos

200 × 20 μl Rxns, 1000 × 20 μl Rxns

Komplekto komponentai

Savybės ir privalumai

■ Paprasta ir efektyvu: naudojant „Cell Direct RT“ technologiją, RNR mėginius galima gauti vos per 7 minutes.

■ Mėginio poreikis mažas, galima ištirti net 10 langelių.

■ Didelis pralaidumas: jis gali greitai aptikti RNR ląstelėse, kultivuotose 384, 96, 24, 12, 6 šulinėlių plokštelėse.

■ DNA Eraser gali greitai pašalinti išlaisvintus genomus, labai sumažinti poveikį tolesniems eksperimentų rezultatams.

■ Dėl optimizuotos RT ir qPCR sistemos dviejų pakopų RT-PGR atvirkštinė transkripcija tampa efektyvesnė, o PGR specifiškesnė ir atsparesnė RT-qPCR reakcijos inhibitoriams.

Komplekto taikymas

Taikymo sritis: kultivuojamos ląstelės.

- RNR, išsiskirianti lizuojant mėginį: taikoma tik šio rinkinio RT-qPCR šablonui.

- Rinkinį galima naudoti šiems tikslams: genų ekspresijos analizei, siRNR sukelto genų slopinimo efekto patikrinimui, vaistų patikrai ir kt.

Diagrama

Sandėliavimas ir galiojimo laikas

Šio rinkinio I dalis turėtų būti laikoma 4 ℃ temperatūroje;II dalis turėtų būti laikoma -20 ℃ temperatūroje.

Foregene Protease Plus II reikia laikyti 4 ℃ temperatūroje, neužšaldyti -20 ℃ temperatūroje.

Reagentas 2×Direct qPCR Mix-SYBR turi būti laikomas -20 ℃ temperatūroje tamsoje;Jei naudojamas dažnai, jis taip pat gali būti laikomas 4 ℃ temperatūroje trumpam laikymui (sunaudoti per 10 dienų). Esame patyrę gamintojai.Laimėję daugumą svarbiausių savo rinkos sertifikatų dėl didelių nuolaidų Kinijos didelio jautrumo vieno žingsnio zondo Rt-Qpcr rinkinys V2, kokybė yra gamyklos gyvenimas, dėmesys klientų poreikiui yra įmonės išlikimo ir plėtros šaltinis. Mes laikomės sąžiningumo ir sąžiningo darbo požiūrio, laukiame jūsų atvykstant!
Didelė nuolaidaKinijos Taq DNR polimerazė, Qpcr, Mūsų įmonė žada: priimtinas kainas, trumpą gamybos laiką ir patenkinamą aptarnavimą po pardavimo, taip pat kviečiame apsilankyti mūsų gamykloje bet kuriuo metu.Linkime, kad dabar turėtume malonų ir ilgalaikį verslą kartu!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPGR Kit -Taqman

Kat.Nr.DRT-01021/01022

Tiesioginiam ląstelių RT-qPCR, naudojant ≤ 1000 000 ląstelių

Produkto pristatymas

Šiame produkte naudojama unikali lizės buferio sistema, skirta greitai atpalaiduoti RNR iš kultivuotų ląstelių mėginių RT-qPCR reakcijoms, pašalinant daug laiko reikalaujantį ir daug pastangų reikalaujantį RNR gryninimo procesą ir tik 7 minutes norint gauti reikiamą RNR šabloną, naudojant 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman, kurį teikia rinkinys.

5× Direct RT Mix ir 2× Direct qPCR Mix-Taqman pasižymi stipriu inhibitorių tolerancija ir gali efektyviai pakeisti bei specifinį amplifikaciją, naudodamas mėginio lizatą, kuris bus matuojamas kaip šablonas.Reagento sudėtyje yra Foregene atvirkštinės transkriptazės, karštosios D-Taq DNR polimerazės, dNTP, MgCl₂, reakcijos buferis, PGR optimizatorius ir stabilizatorius, kurie gali būti naudojami kartu su lizės buferiu, kad būtų galima greitai ir lengvai aptikti mėginius, ir pasižymi dideliu jautrumu, specifiškumu ir stabilumu.

Prekės savybės

Paprasta, efektyvi „Cell Direct RT“ technologija, kuri užtrunka vos 7 minutes RNR mėginiams gauti.

Mėginių poreikis yra nedidelis, o eksperimentams galima naudoti mažiausiai 10 kultivuotų ląstelių.

Didelis našumas greitam RNR gavimui iš kultivuotų ląstelių, tokių kaip 384, 96, 24, 12 ir 6 šulinėlių plokštelės.

„DNR Eraser“ gali greitai pašalinti išlaisvintus genomus, o tai labai sumažina poveikį tolesniems eksperimentų rezultatams.

Optimizuotos RT ir qPCR sistemos įgalina dviejų pakopų RT-PGR su veiksmingesne atvirkštine transkripcija, specifiškumu ir stipresne RT-qPCR reakcijos inhibitorių tolerancija.

Komplekto taikymas

Taikymo sritis: Kultivuojamos ląstelės.

Mėginio lizės interpretuota RNR: naudojama tik kaip dviejų pakopų RT-qPCR šablonas.

Rinkiniai gali būti naudojami šiems tikslams: genų reguliavimo ekspresijos analizei, alelių tyrimui, vaistų patikrai ir kt.

Komplekto apribojimai

Sustiprinti fragmentai ≤ 300 bp.

Rinkiniai naudojami šviežioms ląstelėms auginti.

Produkto kokybės kontrolė

Remiantis FOREGENE visuotinės kokybės valdymo sistema, kiekviena Cell Direct RT-qPCR serijos rinkinių partija yra kelis kartus griežtai tikrinama, siekiant užtikrinti kiekvienos rinkinių partijos kokybės patikimumą ir stabilumą.

Rinkinio turinys

*:Ląstelių lizė, 5×Direct RT Mix, 2×Direct qPCR Mix-Taqman galima įsigyti atskirai, išsami informacija pateikta 1 priede (PUSL. 13).

Laikymo sąlygos

1. Pristatymo sąlygos

Visas žemos temperatūros ledo pakuotės dėžės transportavimo procesas, siekiant užtikrinti, kad rinkinys būtų <4 °C.

2. Laikymo sąlygos

I dalį laikyti 4°C temperatūroje, o II dalį -20°C temperatūroje.

Foregene Protease Plus II reikia laikyti 4°C temperatūroje, neužšaldyti -20°C temperatūroje.

Reagentas 2× Direct qPCR Mix-Taqman yra laikomas -20°C temperatūroje arba 4°C temperatūroje trumpalaikiam naudojimui, jei naudojamas dažnai (per 10 dienų).

Informacija apie rinkinio komponentus

Buferis CL: suteikia aplinką, reikalingą ląstelių lizės reakcijoms.

Buferis ST: nutraukia veikliąją medžiagą lizate, kad būtų išvengta poveikio tolesniam RT.

DNR trintukas: DNR šalinimo priemonė, genomo pašalinimo poveikis tolesniems eksperimentams.

5 × tiesioginis RT mišinys: turi didelį RNR afinitetą Foregene atvirkštinės transkriptazės, RNazės inhibitorių, dNTP, stabilizatorių, stiprintuvų, optimizatorių ir atvirkštinės transkripcijos pradmenų, kad būtų optimalus derinimas (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Gruntas).

Foregene Protease Plus II: Lizės buferio kontekste ląstelės lizuojamos, kad išsiskirtų nukleino rūgštys.

2 × Tiesioginis qPCR Mix-Taqman: Šiame reagente yra karštosios D-Taq DNR polimerazės, dNTP, MgCl₂, reakcijos buferis, PGR optimizatorius ir stabilizatorius.

20 × ROX etaloninis dažiklis: paprastai naudojamas ABI, Stratagene ir kitų kompanijų realaus laiko PGR amplifikacijos prietaisuose, jis naudojamas reguliuoti skirtumą tarp PGR mėgintuvėlių ir vamzdelių, atsiradusių dėl PGR dozavimo klaidų.Skirtingiems instrumentams reikalinga 20× ROX Reference Dye koncentracija yra skirtinga, o vartotojas gali ją pridėti pagal rekomenduojamą instrumento koncentraciją.

DdH be RNazių₂O: sterilizuotas itin grynas vanduo be RNazės, skirtas dviejų pakopų RT-qPCR reakcijoms.

Atsargumo priemonės:(Prieš naudodami rinkinį būtinai atidžiai perskaitykite atsargumo priemones)

Atkreipkite dėmesį į eksperimento veikimo būdą, kad išvengtumėte kryžminio mėginių užteršimo.

Atkreipkite dėmesį į eksperimentinės aplinkos ir įrankių švarą, kad išvengtumėte užteršimo Rnaze ir RNR skilimo.

Imkite šviežius arba gerai išsilaikiusius ląstelių mėginius ir niekada nenaudokite kartotinių užšaldytų arba atšildytų ląstelių mėginių.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman turėtų vengti pakartotinio užšaldymo ir atšildymo, kitaip tai turės įtakos atvirkštinei transkripcijai ir PGR efektyvumui.

Pasiruoškitedaviniuspriešoperacija

Prieš naudodami šį rinkinį, būtinai atidžiai perskaitykite instrukcijas.„Cell Direct RT-qPCR“ rinkinys yra paprastas, patogus ir greitai valdomas, o instrukcijose pateikiama išsami informacija apie visą rinkinį ir kaip jį teisingai naudoti.Prieš naudodami paruoškite reikiamas eksperimentines medžiagas ir įrangą.

Eksperimentinės medžiagos ir įranga

◆ Kultūros ląstelės.

◆ 1,5 ml arba 2 ml, centrifugos mėgintuvėlis be RNazės/DNazės, antgalis be RNazės/DNazės, 0,2 ml sterilus qPCR mėgintuvėlis.

◆ qPCR aparatas, pipetė, stalinė centrifuga (≥13 400×g) (priklausomai nuo eksperimentinių poreikių) ir kt.

Saugumas

◆ Šis gaminys skirtas tik moksliniams tyrimams, nenaudokite jo farmacijos, klinikiniais, maisto ir kosmetikos tikslais.

◆ Naudodami chemines medžiagas, dėvėkite tinkamus laboratorinius drabužius, pirštines, apsauginius akinius ir pan.

Operacijavedliai

Ląstelių lizės sistemas, RT sistemas ir qPCR reakcijos tirpalo papildymo pakuotes galima įsigyti atskirai, daugiau informacijos rasite 1 priede (PUSL. 13).

Naudojimo vadovas

A: RNR išleidimo pavyzdys

1. Ląstelės buvo iš anksto apdorotos: Nuplaukite ląstelių kultūros plokštelę šaltu PBS, tada ląskite ląsteles (10-10⁶), 10⁶ nei ląstelių kiekis, RNR ekstrahavimui ir gryninimui rekomenduojamas Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) arba Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011).

1.1.Prilipusios ląstelės (24 šulinėlių plokštelė kaip pavyzdys)

1.1.1.Nustatykite ląstelių skaičių kiekviename šulinyje, nustatykite, kad ląstelių skaičius būtų 1 × 10⁵, ir pipete išimkite auginimo terpę iš auginimo lėkštelės.

1.1.2.Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 200 μl iš anksto atšaldyto 1 × PBS.Nepilkite pipetės pakartotinai ir pašalinkite PBS iš šulinėlių.Pakreipkite plokštelę ir pašalinkite kiek įmanoma daugiau PBS.Pereikite prie 2 veiksmo.

1.1.3.Ląstelių plovimui buvo pridėta iš anksto atšaldyta 1 × PBS į skirtingą ląstelių kultūros lėkštelę arba nuorodų numerių lentelę 1-1 į ląstelių kultūros lėkštelę.

1-1 lentelė: PBS dozė skirtingam ląstelių skaičiui

Pastaba：Siekiant užtikrinti tvirtą sukibimą ląstelėse，plaunant išvengiama daug ląstelių praradimo.

1.2.Suspensijos ląstelės arba prilipusios ląstelės, kultivuojamos neakytose plokštelėse

1.2.1.Prilipusios ląstelės, kultivuojamos ne kelių šulinėlių plokštelėse (suspensijos ląstelės pradedamos nuo kito 1.2.2 etapo), surenkamos ir atskiriamos ląstelės pagal įprastą ląstelių surinkimo metodą ir dedamos į auginimo plokštelę arba centrifugavimo mėgintuvėlį;jei naudojamas tripsinizavimas, reikia centrifuguoti ląstelėms surinkti ir tripsino likučiui pašalinti, į atskiras ląsteles įpilkite PBS resuspenduotų ląstelių, kad ląstelės būtų išsklaidytos.

1.2.2.Suskaičiavus ląstelių skaičių, ląstelės suskirstytos į alikvotas 1 × 10⁵ vienas centrifuguoti mėgintuvėlius, surenkamos ląstelės centrifuguojant 1000 × g 10 min.

1.2.3.Į centrifugos mėgintuvėlį įpilkite 200 μl PBS, nepilkite pipete pakartotinai ir tiesiogiai išsiurbkite PBS.pereikite prie 2 veiksmo. (Jei sunku nusodinti ir ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos, galima atlikti 1000 × g centrifuguojant 10 minučių po supernatanto išmetimo, ląstelių nuosėdos pereikite prie 2 veiksmo)

2. Ląstelių lizė: Pašalinkite buferį CL, kurio temperatūra subalansuota iki kambario temperatūros, DNA Eraser ir Foregene Protease Plus II, pagal šią 1-2 lentelę paruošta lizės sistema: (lizės tirpalas paruoštas naudoti).

1-2 lentelė: skilimas sistemos paruošimas (Pastaba: ruošiant ant ledo)

3. (24 šulinėlių plokštelė kaip pavyzdys) Į kiekvieną šulinėlį pipete įlašinkite 200 μl ląstelių lizės pagrindinio mišinio, pakartotinai pūskite 5–10 kartų, inkubuokite kambario temperatūroje (20–25 ℃) 5 min.

Pastaba：Kad nesusidarytų burbuliukai, pipetės metu pipetės skalė buvo nustatyta iki 200 μl ar mažiau.Po lizės ląstelės gali atrodyti drumstos, o tai yra normalu.

4. (24 šulinėlių plokštelė, kaip pavyzdys) į skystį įpilama 20 μl buferio ST (skirtingos lizės sistemos Buferis ST pridedamas tokiu kiekiu, kaip parodyta 1-3 lentelėje), kartojama pipete 5-10 kartų, kambario temperatūroje (20-25 ℃) inkubuojama 2 min.

Pastaba：Pipetės antgalis buvo po paviršiumi, užtikrinant, kad būtų pridėtas lizatas，Kad nesusidarytų burbuliukai, pipetės metu pipetės skalė buvo nustatyta iki 200 μl ar mažiau.

1-3 lentelė：Pridėti buferį ST

5. Lizatas naudojamas tolesniems RT-qPCR eksperimentams.Jei tolesnių eksperimentų negalima atlikti laiku, laikykite jį ant ledo ne ilgiau kaip 2 valandas ir laikykite -20 ℃ arba -80 ℃ temperatūroje (ne ilgiau kaip tris mėnesius).

B: RT sistemos paruošimas

1.Išimkite 5 × Direct RT Mix ir padėkite ant ledo vonelės, leiskite natūraliai ištirpti ir švelniai išmaišykite vėlesniam naudojimui;Išimkite RNase-Free ddH2O, ištirpinkite ir padėkite ant ledo vonios, kad galėtumėte naudoti vėliau.Paruoškite reakcijos sistemą ant ledo pagal toliau pateiktą 2-1 lentelę.

2-1 lentelė: RT reakcijos sistemos paruošimas

2.Pabaigus sistemos formulavimą, švelniai sumaišykite ir trumpai centrifuguokite toliau pateiktoje 2-2 lentelėje reakcijos sąlygos RT reakcija.

2-2 lentelė: RT Reakcijos sąlygos nustatymas

3. Pasibaigus reakcijai, reakcijos produktas buvo dedamas tiesiai ant ledo, kad būtų atliktas qPCR, ilgalaikiam konservavimui padėkite -20 ℃ arba -80 ℃.

Pastaba: naudojant neišgrynintą šabloną, atvirkštinės transkripcijos produkte gali atsirasti baltų nuosėdų.Tai normalus reiškinys.Nedelsdami centrifuguokite supernatantą tolesniems eksperimentams.

Gautas RT reakcijos tirpalas pridedamas prie kito etapo realaus laiko PGR reakcijos sistemų, rekomenduojama dėti kiekius nuo 10-30% reakcijos sistemos.

C: qPCR reakcijos sistemos paruošimas

1. Tinkamas B kiekis, paruoštas cDNR šablono žingsnyje pagal šią 3-1 lentelę, kad būtų paruošta reakcijos sistema.

Pastaba: cDNR šablono kiekis sudaro 10–30 % qPCR sistemos.Pavyzdžiui, į 20 μl qPCR sistemą įpilkite 2–6 μl lizės buferio, bet ne daugiau kaip 6 μl.

2. Gerų qPCR sąlygų optimizavimas (atkaitinimo temperatūra ir tt) qPCR reakcijai (reakcijos sąlygos pateiktos 3-2 lentelėje).

Pastaba: norėdami gauti geresnių rezultatų, stenkitės naudoti optimizuotas qPCR reakcijų sąlygas.

3-1 lentelė: PGR reakcijos sistemos paruošimas

1*: pradmenų koncentraciją galima reguliuoti 50–900 nM diapazone, kai pradmenų reakcija yra prasta.

Pastaba: qPCR sistemą galima koreguoti pagal eksperimentinius poreikius ir fluorescencinio ciklo modelį.qPCR atveju 50μl sistemoje, proporcingai sureguliuokite reagento dozę pagal 20μl sistema.

2*: pasirinkite tinkamą galutinę ROX etaloninio dažo koncentraciją pagal fluorescencijos kiekybinį terminį ciklą.Tinkamiausios ROX etaloninių dažų koncentracijos įprastiems kiekybiniams fluorescenciniams ciklams pateiktos toliau pateiktoje lentelėje:

3-2 lentelė: pateiktos qPCR reakcijos sąlygos

Pastaba: norint gauti geriausią qPCR efektą, galima naudoti gradiento PGR, kad būtų optimizuotos skirtingų šablonų ir skirtingų pradmenų reakcijos sąlygos.PGR reakcijos sąlygos skiriasi priklausomai nuo fluorescencijos analizatoriaus, šablono, pradmenų ir tt Atliekant konkrečią operaciją, optimalios reakcijos sąlygos turi būti sukurtos atsižvelgiant į specifines fluorescencijos kiekybinio terminio ciklo sąlygas, šablono tipą, dominančio fragmento dydį, amplifikuoto fragmento bazių seką ir GC kiekį bei pradmenų ilgį, įskaitant atkaitinimo temperatūrą, reakcijos laiką ir kt.

Realaus laiko PGR pradmenų projektavimo principai

Priekinis gruntas ir atvirkštinis gruntas

Realaus laiko PGR atveju pradmenų dizainas yra labai svarbus.Pradmenys yra susiję su PGR amplifikacijos specifiškumu ir efektyvumu ir gali būti sukurti remiantis šiais principais:

◆ Grunto ilgis: 18-30bp.

◆ GC kiekis: 40-60%.

◆ Tm reikšmė: Grunto projektavimo programinė įranga, tokia kaip Primer 5, gali pateikti grunto Tm vertę.Prieš srovę ir pasroviui esančių pradmenų Tm vertės turi būti kuo artimesnės.Taip pat galima naudoti Tm skaičiavimo formulę: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Atliekant PGR, kaip atkaitinimo temperatūra paprastai pasirenkama žemesnė už pradmenų Tm reikšmę 5 °C temperatūra (atitinkamas atkaitinimo temperatūros padidėjimas gali padidinti PGR reakcijos specifiškumą).

◆ Gruntai ir PGR produktai:

◆ Dizaino pradmenų PGR amplifikacijos produkto ilgis pageidautina 100-150 bp.

◆ Reikėtų kiek įmanoma vengti dizaino gruntų antrinėje šablono struktūrinėje srityje.

◆ Venkite 2 ar daugiau papildančių bazių susidarymo tarp 3′ galų prieš srovę ir pasroviui pradmenų.

◆ Primer 3′ gnybtų pagrindo negali būti su 3 papildomais iš eilės G arba C.

◆ Patys pradmenys negali turėti viena kitą papildančių struktūrų, kitaip susiformuos plaukų segtuko struktūra, turinti įtakos PGR amplifikacijai.

◆ Pradmenų sekoje ATCG turėtų būti paskirstytas kuo tolygiau, o 3′ galinės bazės turėtų būti vengiama kaip T.

Priedas1：Cell TiesioginisRT-qPCR Komplekto komponentast papildų pakuotė

1.Ląstelių lizės tirpalas