Gerai žinoma, kad centrinėje dogmoje RNR yra transkripcijos tarpininkas tarp DNR ir baltymų ekspresijos.Palyginti su DNR aptikimu, RNR aptikimas gali objektyviau atspindėti genų ekspresiją organizmuose.Eksperimentai su RNR apima: qRT-PGR, RNR-Seq ir suliejimo genų aptikimą ir tt Remiantis pačios RNR savybėmis (RNR cukranendrių žiede yra viena daugiau laisvos hidroksilo grupės nei DNR cukriniame žiede), kartu su daugybe RNazių aplinkoje, RNR yra nestabilesnė ir lengviau skaidoma nei DNR.Šiukšlės į, šiukšlės išvežamos, jei RNR kokybė nėra gera, tai eksperimento rezultatai turi būti nepatenkinami, konkrečiai pasireiškiantys netiksliais duomenimis arba prastu pakartojamumu.Todėl daugiau dėmesio reikėtų skirti RNR apdorojimui, o kokybės kontrolės ryšys taip pat yra svarbesnis siekiant užtikrinti vėlesnių eksperimentinių duomenų tikslumą ir tikslumą.

RNR kokybės kontrolei paprastai naudojami šie dažniausiai naudojami metodai:

• Spektrofotometrija
• agarozės gelio elektroforezė
• Agilent Bioanalyzer
• realaus laiko fluorescencinė kiekybinė PGR
• Qubit fluorescencinių dažų metodas

01 Spektrofotometrija

RNR turi konjuguotas dvigubas jungtis ir turi absorbcijos smailę esant 260 nm bangos ilgiui.Pagal Lamberto-Beerio dėsnį RNR koncentraciją galime apskaičiuoti pagal absorbcijos smailę esant 260 nm.Be to, mes taip pat galime apskaičiuoti RNR grynumą pagal 260 nm, 280 nm ir 230 nm absorbcijos smailių santykį.280 nm ir 230 nm yra atitinkamai baltymų ir mažų molekulių absorbcijos smailės.Kvalifikuoto RNR grynumo A260/A280 ir A260/A230 santykis turi būti didesnis nei 2. Jei jis mažesnis nei 2, tai reiškia, kad RNR mėginyje yra baltymo arba mažos molekulės užteršimo ir jį reikia išgryninti dar kartą.Taršos šaltiniai turės įtakos tolesniems eksperimentams, pvz., slopins PGR reakcijų amplifikacijos efektyvumą, todėl bus gauti netikslūs kiekybiniai rezultatai.RNR grynumas turi didelę įtaką tolesniems rezultatams, todėl spektrofotometrija paprastai yra nepakeičiama kokybės kontrolės grandis pirmajame nukleino rūgščių eksperimentų etape.

1 pav. Tipinis RNR/DNR absorbcijos spektras

02 Agarozės gelio elektroforezė

Be grynumo, RNR vientisumas taip pat yra vienas iš svarbių rodiklių sprendžiant apie RNR kokybę.Dėl RNR skilimo mėginyje atsiras daug trumpų fragmentų, todėl sumažės RNR fragmentų, kuriuos galima efektyviai aptikti ir padengti etalonine seka, skaičius.RNR vientisumą galima patikrinti atliekant visos RNR elektroforezę 1% agarozės gelyje.Šiuo metodu galite patys sukonfigūruoti gelį arba naudoti surenkamą E-Gel™ sistemą vientisumui patikrinti.Daugiau nei 80% visos RNR yra ribosominė RNR, kurios didžiąją dalį sudaro 28S ir 18S rRNR (žinduolių sistemose).Geros kokybės RNR parodys dvi akivaizdžias ryškias juostas, kurios yra atitinkamai 28S ir 18S ryškios juostos, esant 5 Kb ir 2 Kb, o santykis bus artimas 2:1.Jei jis yra išsklaidytos, tai reiškia, kad RNR mėginys galėjo būti suskaidytas, todėl rekomenduojama naudoti vėliau aprašytą metodą tolesniam RNR kokybės tyrimui.

2 pav. Suardytos (2 juosta) ir nepažeistos RNR (3 juosta) palyginimas naudojant agarozės gelio elektroforezę

03 Agilent Bioanalyzer

Be aukščiau aprašyto agarozės gelio elektroforezės metodo, kuris gali padėti mums paprastai ir greitai nustatyti RNR vientisumą, RNR vientisumui nustatyti galime naudoti ir Agilent bioanalizatorių.RNR koncentracijai ir vientisumui įvertinti naudojamas mikrofluidikos, kapiliarinės elektroforezės ir fluorescencijos derinys.Naudodamas integruotą algoritmą RNR mėginio profiliui analizuoti, Agilent bioanalyzer gali apskaičiuoti etaloninę RNR vientisumo reikšmę, RNR vientisumo numerį (toliau – RIN) [1].Kuo didesnė RIN reikšmė, tuo didesnis RNR vientisumas (1 yra labai susilpnėjęs, 10 – išsamiausias).Kai kurie eksperimentai su RNR siūlo naudoti RIN kaip kokybės vertinimo parametrą.Kaip pavyzdį imant didelio našumo sekos nustatymo eksperimentus (toliau – NGS), Oncomine™ žmogaus imuninio repertuaro gairės, naudojamos B ląstelių ir T ląstelių antigenų receptoriams aptikti Thermo Fisher's Oncomine skydelių serijoje, rodo, kad mėginiai, kurių RIN reikšmės yra didesnės nei 4, galima išmatuoti efektyvesnius skaitymus ir klonus3 (Figure).Skirtingoms plokštėms rekomenduojami skirtingi diapazonai, o dažnai didesnis RIN gali pateikti efektyvesnius duomenis.

3 paveikslas, Oncomine™ žmogaus imuninio repertuaro eksperimentuose, mėginiai, kurių RIN didesnis nei 4, gali aptikti efektyvesnius skaitymus ir T ląstelių klonus.【2】

Tačiau RIN reikšmė taip pat turi tam tikrų apribojimų.Nors RIN turi didelę koreliaciją su NGS eksperimentinių duomenų kokybe, jis netinka FFPE mėginiams.FFPE mėginiai buvo chemiškai apdoroti ilgą laiką, o išgauta RNR paprastai turi santykinai mažą RIN vertę.Tačiau tai nereiškia, kad veiksmingi eksperimento duomenys turi būti nepatenkinami.Norėdami tiksliai įvertinti FFPE mėginių kokybę, turime naudoti kitus matavimus nei RIN.Be RIN, Agilent bioanalyzer taip pat gali apskaičiuoti DV200 vertę kaip RNR kokybės vertinimo parametrą.DV200 yra parametras, apskaičiuojantis didesnių nei 200 bp fragmentų dalį RNR mėginyje.DV200 yra geresnis FFPE mėginio kokybės rodiklis nei RIN.FFPE išgauta RNR labai koreliuoja su genų, kuriuos galima efektyviai aptikti, skaičiumi ir genų įvairove [3].Nors DV200 gali kompensuoti FFPE kokybės nustatymo trūkumus, Agilent bioanalizatorius vis tiek negali visapusiškai išanalizuoti RNR mėginių kokybės problemų, įskaitant tai, ar mėginiuose yra inhibitorių.Patys inhibitoriai gali paveikti tolesnių eksperimentų stiprinimo efektyvumą ir sumažinti naudingų duomenų kiekį.Norėdami sužinoti, ar mėginyje yra inhibitorių, galime naudoti realaus laiko fluorescencinį kiekybinį PGR metodą, aprašytą toliau.

04 realaus laiko fluorescencinė kiekybinė PGR

Realaus laiko fluorescencinis kiekybinis PGR metodas gali ne tik aptikti mėginyje esančius inhibitorius, bet ir tiksliai atspindėti RNR kokybę FFPE mėginyje.Palyginti su Agilent biologiniais analizatoriais, realaus laiko fluorescencijos kiekybiniai instrumentai yra populiaresni pagrindinėse biologinėse laboratorijose dėl platesnio jų taikymo.Norint patikrinti RNR mėginių kokybę, mums tereikia įsigyti arba paruošti pradmenų zondus vidiniams etaloniniams genams, pvz., GUSB (kat. Nr. Hs00939627).Naudojant šį pradmenų, zondų ir standartų rinkinį (bendra žinomos koncentracijos RNR) atlikti absoliučius kiekybinius eksperimentus, efektyvią RNR fragmentų koncentraciją galima apskaičiuoti kaip RNR kokybės vertinimo standartą (sutrumpintai Funkcinis RNR kvantavimas (FRQ)).Atlikdami NGS testą, nustatėme, kad RNR mėginių FRQ turi labai didelę koreliaciją su efektyviu duomenų kiekiu.Visų mėginių, didesnių nei 0,2 ng/uL FRQ, bent 70 % rodmenų gali veiksmingai apimti atskaitos seką (4 pav.).

4 pav. FRQ reikšmė, nustatyta kiekybiniu fluorescenciniu metodu, turi labai didelę koreliaciją (R2>0,9) su efektyviais duomenimis, gautais atliekant NGS eksperimentą.Raudona linija yra FRQ reikšmė, lygi 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Realaus laiko kiekybinis PGR metodas ne tik taikomas FFPE mėginiams, bet ir gali veiksmingai stebėti inhibitorius mėginiuose.Aptinkamą mėginį galime įtraukti į reakcijos sistemą naudodami vidinę teigiamą kontrolę (IPC) ir jos tyrimą, o tada atlikti fluorescencijos kiekybinį įvertinimą, kad gautume Ct vertę.Jei reakcijoje be mėginio Ct reikšmė atsilieka nuo Ct vertės, tai rodo, kad inhibitorius yra mėginyje ir slopina amplifikacijos efektyvumą reakcijoje.

05 Qubit fluorescencinių dažų metodas

„Qubit Fluorometer“ yra dažniausiai naudojamas mažas nukleino rūgščių koncentracijos ir grynumo nustatymo prietaisas, kurį lengva valdyti ir kuris egzistuoja beveik kiekvienoje molekulinės biologijos laboratorijoje.Jis tiksliai apskaičiuoja nukleino rūgšties koncentraciją aptikdamas ir surišantį fluorescencinį dažiklį (Qubit aptikimo reagentas).Qubit pasižymi dideliu jautrumu ir specifiškumu ir gali tiksliai nustatyti RNR kiekį iki pg/µL koncentracijos.Be gerai žinomo gebėjimo tiksliai kiekybiškai įvertinti nukleorūgščių koncentraciją, naujausias naujas Thermo Fisher modelis Qubit 4.0 taip pat gali aptikti RNR vientisumą.Qubit 4.0 RNR aptikimo sistema (RNA IQ Assay) aptinka RNR vientisumą vienu metu aptikdama du specifinius fluorescencinius dažus.Šie du fluorescenciniai dažai gali atitinkamai prisijungti prie didelių ir mažų RNR fragmentų.Šie du fluorescenciniai dažai rodo didelių RNR fragmentų proporciją mėginyje, ir iš to galima apskaičiuoti RNR kokybę atspindinčią IQ (vientisumo ir kokybės) reikšmę.IQ reikšmė taikoma tiek FFPE, tiek ne FFPE mėginiams ir turi didelę įtaką vėlesnei sekos kokybei.Kaip pavyzdį paėmus NGS eksperimentus, RNA-Seq bandymo eksperimentuose, atliktuose Ion torrent™ platformoje, daugumos mėginių, kurių IQ reikšmės buvo didesnės nei 4, veiksmingi rodmenys buvo bent 50 % (5 pav.).Lyginant su aukščiau minėtais aptikimo metodais, Qubit IQ Assay yra ne tik patogiau valdyti ir užtrunka trumpiau (per penkias minutes), bet ir turi didelę koreliaciją tarp išmatuoto parametro IQ reikšmės ir tolesnių eksperimentų duomenų kokybės.

5 paveiksle yra didelis ryšys tarp Qubit RNA IQ reikšmės ir susietų RNA-Seq rodmenų.【5】

Per pirmiau pateiktą įžangą manau, kad kiekvienas turi pakankamai supratimo apie skirtingus RNR kokybės kontrolės metodus.Praktiškai galite pasirinktiatitinkamas metodas pagal imties tipą ir esamas priemones.Tik gerai kontroliuojant RNR kokybę galime išvengti vėlesnių eksperimentų nesėkmės, kurią sukelia prastos mėginio kokybės, taip sutaupydami brangų laiką, energiją ir išlaidas.

Referenciniai produktai:

Gyvūnų bendros RNR izoliacijos rinkinys

Ląstelių bendros RNR izoliacijos rinkinys

nuorodos

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. ir kt.RIN: RNR vientisumo numeris, skirtas RNR matavimams priskirti vientisumo reikšmes.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine žmogaus imuninio repertuaro vartotojo vadovas (leidimo Nr. MAN0017438, C.0 red.).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, patobulintos kokybės metrika, skirta RNR, gautos iš archyvinių formalinu fiksuoto parafino įterptų audinių mėginių, vertinimo metrika 357–373 psl.https://doi.org/10.1093/toxsci/