Problemų analizės vadovai

The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。

RNR negalima išgauti arba nukleino rūgšties išeiga yra maža

Paprastai yra daug veiksnių, turinčių įtakos regeneravimo efektyvumui, pavyzdžiui: mėginio RNR kiekis, veikimo būdas, eliuavimo tūris ir kt.

Įprastų priežasčių analizė:

1.Ledo vonia arba žemos temperatūros (4 °C) centrifugavimas veikimo metu.

Patarimas: Kambario temperatūros (15-25 °C) veikimas, niekada nenaudokite ledo vonios ir žemos temperatūros centrifugos.

2. Netinkamas mėginių laikymas arba per ilgas mėginių laikymas.

Patarimas: Mėginius laikykite -80 °C temperatūroje arba užšaldykite skystame azote, venkite pakartotinio užšaldymo ir atšildymo;pabandykite naudoti ką tik paimtus mėginius RNR ekstrakcijai.

3. Nepakankama mėginio lizė

Rekomendacija: įsitikinkite, kad mėginys ir darbinis tirpalas (linijinis akrilamidas) buvo kruopščiai sumaišyti ir inkubuojami 10 minučių kambario temperatūroje (15-25 °C).

4. Eliuentas buvo pridėtas neteisingai

Rekomendacija: Įsitikinkite, kad RNase-Free ddH2O būtų pridėta į valymo kolonėlės membranos vidurį

5. Netinkamas bevandenio etanolio kiekis buferyje viRW2

Patarimas: vadovaukitės instrukcijomis, įpilkite reikiamą kiekį bevandenio etanolio į buferį viRW2 ir gerai išmaišykite prieš naudodami rinkinį.

6.Netinkamas mėginio naudojimas.

Siūlymas: 200 µl mėginio 500 µl buferio viRL.Per didelis mėginio tūris sumažins RNR ekstrahavimo greitį.

7.Netinkamas eliuavimo tūris arba nepilnas eliuavimas.

Siūlymas: gryninimo kolonėlės eliuento tūris yra 30-50μl;jei eliuavimo efektas nėra patenkinamas, rekomenduojama įpilti iš anksto pašildyto RNase-Free ddH₂O ir pailginkite laikymo kambario temperatūroje laiką, pvz., 5-10min

8. Išplovus buferiu viRW2, valymo kolonėlėje yra etanolio likučių.

Patarimas: Jei po skalavimo buferiu viRW2 ir centrifugavimo tuščiame mėgintuvėlyje 2 min. lieka etanolio, po centrifugavimo tuščiame mėgintuvėlyje valymo kolonėlę galima palikti kambario temperatūroje 5 min., kad būtų visiškai pašalintas likęs etanolis.

Išgrynintų RNR molekulių skilimas

Išgrynintos RNR kokybė yra susijusi su tokiais veiksniais kaip mėginio saugojimas, užterštumas Rnaze ir veikimas.

Įprastų priežasčių analizė:

1. Paimti mėginiai nebuvo laiku išsaugoti.

Patarimas: Jei po paėmimo mėginys nepanaudojamas laiku, nedelsdami laikykite jį -80 ℃ temperatūroje arba skystame azote.Jei įmanoma, RNR molekulėms išgauti stenkitės naudoti šviežiai paimtus mėginius.

2. Paimti mėginiai buvo pakartotinai užšaldomi ir atitirpinami.

Patarimas: mėginio ėmimo ir laikymo metu vengti pakartotinio užšaldymo ir atšildymo (ne daugiau kaip vieną kartą), kitaip sumažės nukleino rūgšties išeiga.

3. Operacinėje buvo įvesta RNazė arba nedėvėti vienkartinių pirštinių, kaukių ir pan.

Pasiūlymas: RNR molekulių ekstrahavimo eksperimentą geriausia atlikti atskiroje RNR operacinėje patalpoje, o eksperimento stalas prieš eksperimentą nuvalomas.Eksperimento metu dėvėkite vienkartines pirštines ir kaukes, kad išvengtumėte RNR degradacijos, kurią sukelia RNazės įvedimas.

4. Naudojimo metu reagentas yra užterštas RNaze.

Patarimas: susijusiems eksperimentams pakeiskite nauju virusinės RNR izoliacijos rinkiniu.

5. Centrifugos mėgintuvėlių, pipetės antgalių ir tt užteršimas RNaze. Patarimas: Įsitikinkite, kad centrifugos mėgintuvėliuose, pipetės antgaliuose ir pipetėse nėra RNazės.

Išgrynintos RNR molekulės paveikė tolesnius eksperimentus

RNR molekulės, išgrynintos valymo kolonėlėje, turės įtakos tolesniems eksperimentams, jei yra per daug druskos jonų arba baltymų, pvz., atvirkštinė transkripcija, Northern blot ir kt.

1.Iliuotose RNR molekulėse yra likusių druskų jonų.

Rekomendacija: Įsitikinkite, kad į buferį viRW2 buvo įpiltas reikiamas kiekis bevandenio etanolio, ir du kartus išplaukite valymo kolonėlę pagal teisingą centrifugavimo greitį, nurodytą naudojimo instrukcijose；Jei dar liko druskos jonų, į valymo kolonėlę galite įpilti buferio viRW2 ir palikti kambario temperatūroje 5 min.Tada atlikite centrifugavimą, kad kuo labiau pašalintumėte druskos jonų užterštumą

2.Iliuotose RNR molekulėse liko etanolio

Patarimas: įsitikinę, kad valymo kolonėlės buvo išskalautos buferiu viRW2, centrifuguokite tuščiame mėgintuvėlyje pagal naudojimo instrukcijose nurodytą išcentrinį greitį.Jei vis dar liko etanolio, po centrifugavimo tuščiame mėgintuvėlyje jį galima palikti 5 minutėms kambario temperatūroje, kad būtų pašalintas didžiausias likęs etanolis.

Instrukcijų vadovai:

Virusinės RNR izoliacijos rinkinio naudojimo vadovas