1. Pradinis supratimas

Šiame etape turime suprasti kai kurias sąvokas ir terminiją, kad nepadarytume klaidų savo vyresniųjų akivaizdoje, pavyzdžiui:

K: Kuo skiriasi RT-PGR, qPCR, realaus laiko PGR ir realaus laiko RT-PGR?

Atsakymas: RT-PGR yra atvirkštinės transkripcijos PGR(atvirkštinės transkripcijos PGR, RT-PGR), kuris yra plačiai naudojamas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) variantas.Atliekant RT-PGR, RNR grandinė yra atvirkštinė transkribuota į komplementarią DNR, kuri vėliau naudojama kaip šablonas DNR amplifikacijai atliekant PGR.
Realaus laiko PGR ir qPCR(Kiekybinis realiojo laiko-PGR) yra tas pats dalykas, abu yra realaus laiko kiekybiniai PGR, o tai reiškia, kad kiekvienas PGR ciklas turi realaus laiko duomenų įrašus, todėl pradinių šablonų skaičių galima koreguoti atliekant tikslią analizę.

Nors atrodo, kad tiek realiojo laiko PGR (realaus laiko fluorescencinė kiekybinė PGR), tiek atvirkštinės transkripcijos PGR (atvirkštinės transkripcijos PGR) yra sutrumpinti kaip RT-PGR, tarptautinė konvencija yra tokia: RT-PGR konkrečiai reiškia atvirkštinę transkripciją.PGR, realaus laiko PGR paprastai sutrumpintas kaip qPCR (kiekybinis realaus laiko PGR)..

Ir realaus laiko RT-PCR (RT-qPCR), tai atvirkštinės transkripcijos PGR kartu su fluorescencine kiekybine technologija: pirmiausia gaukite cDNR (RT) iš RNR atvirkštinės transkripcijos, o tada naudokite realaus laiko PGR kiekybinei analizei (qPCR).Dauguma laboratorijų atlieka RT-qPCR, tai yra, RNR ekspresijos sumažinimo tyrimus, todėl qPCR, apie kurį visi kalba laboratorijoje, iš tikrųjų reiškia RT-qPCR, tačiau nepamirškite, kad vis dar yra daug DNR tyrimų klinikinėje praktikoje.Kiekybinė analizė, pvz., hepatito B viruso HBV nustatymas.

Klausimas: Kodėl perskaičius daug fluorescencinės kiekybinės PGR, amplifikuotas fragmentas turėtų būti kontroliuojamas 80–300 bp diapazone?

Atsakymas: Kiekvienos genų sekos ilgis yra skirtingas, kai kurie yra keli kb, kai kurie yra šimtai bp, bet projektuojant pradmenis reikia tik reikalauti, kad produkto ilgis būtų 80-300 bp, per trumpas arba per ilgas netinka fluorescenciniam kiekybiniam PGR aptikimui.Produkto fragmentas per trumpas, kad jį būtų galima atskirti nuo pradmenų-dimerio.Grunto-dimerio ilgis yra apie 30-40bp, sunku atskirti, ar tai gruntas-dimeris, ar produktas, jei jis mažesnis nei 80 bp.Jei produkto fragmentas yra per ilgas, viršijantis 300 bp, tai lengvai sukels žemą amplifikacijos efektyvumą ir negalės veiksmingai aptikti geno kiekio.

Pavyzdžiui, kai skaičiuojate, kiek žmonių yra klasėje, tereikia suskaičiuoti, kiek yra burnų.Tas pats pasakytina ir kai aptinkate genus, jums tereikia aptikti tam tikrą geno seką, kad būtų parodyta visa seka.Jei nori skaičiuoti žmones, reikia skaičiuoti ir burnas, ir nosis, ir ausis, ir akinius, o suklysti lengva.

Plėsti, biologiniuose tyrimuose yra daug tyrimų atvejų iš taško į sritį, nes bet kurios rūšies genų seka yra labai ilga, nebūtina ir neįmanoma išmatuoti visų fragmentų, pvz., bakterijų 16S sekos nustatymas, ty atlikti konservatyvią bakterijų seką.

K: Koks yra optimalus qPCR pradmenų dizaino ilgis?

Atsakymas: Paprastai kalbant, pradmenų ilgis yra apie 20–24 bp, o tai yra geriau.Žinoma, kurdami gruntą turime atkreipti dėmesį į grunto TM reikšmę, nes tai yra susijusi su optimalia atkaitinimo temperatūra.Po daugybės eksperimentų buvo įrodyta, kad 60°C yra geresnė TM vertė.Jei atkaitinimo temperatūra yra per žema, tai lengvai sukels nespecifinį stiprinimą.Jei atkaitinimo temperatūra yra per aukšta, stiprinimo efektyvumas bus palyginti mažas, stiprinimo kreivės pikas prasidės vėliau, o CT reikšmė bus atidėta.

K: Kuo dažų metodas skiriasi nuo zondo metodo?

Atsakymas: Dažų metodasKai kurie fluorescenciniai dažai, tokie kaip SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO ir kt., patys neskleidžia šviesos, bet išspinduliuos fluorescenciją, kai prisijungs prie mažos dvigrandės DNR griovelio.Todėl PGR reakcijos pradžioje aparatas negali aptikti fluorescencinio signalo.Kai reakcija pasiekia atkaitinimo-pratęsimo stadiją, dviguba grandinė atidaroma ir veikiant DNR polimerazei susintetinama nauja grandinė, o fluorescencinė molekulė prisijungia prie dsDNR mažojo griovelio.Didėjant PGR ciklų skaičiui, vis daugiau dažiklių derinama su dvigrande DNR, o fluorescencinis signalas taip pat nuolat stiprinamas.Dažymo metodas daugiausia naudojamas moksliniuose tyrimuose.
PS: Atlikdami eksperimentą būkite atsargūs, dažai turi būti sujungti su žmogaus DNR, būkite atsargūs, kad paverstumėte jį fluorescenciniu žmogumi.

Dažų metodas (kairėje) Zondo metodas (dešinėje)
PS: Atlikdami eksperimentą būkite atsargūs, dažai turi būti sujungti su žmogaus DNR, būkite atsargūs, kad paverstumėte jį fluorescenciniu žmogumi.

SYBR Green Ⅰ jungiasi prie nedidelio DNR griovelio

Zondo metodasTaqman zondas yra dažniausiai naudojamas hidrolizės zondas.Zondo 5′ gale yra fluorescencinė grupė, dažniausiai FAM, o pats zondas yra seka, papildanti tikslinį geną.3′ gale yra fluorescencinė gesinimo grupė.Pagal fluorescencinio rezonanso energijos perdavimo principą (Förster resonance energy transfer, FRET), kai sužadinama reporterio fluorescencinė grupė (fluorescencinė molekulė donorė) ir gesinanti fluorescencinė grupė (akceptorinė fluorescencinė molekulė). ule, o autofluorescencija susilpnėja.Todėl PGR reakcijos pradžioje, kai zondas sistemoje yra laisvas ir nepažeistas, reporterio fluorescencinė grupė neskleis fluorescencijos.Atkaitinimo metu gruntas ir zondas prisijungia prie šablono.Prailginimo stadijoje polimerazė nuolat sintezuoja naujas grandines.DNR polimerazė turi 5′-3′ egzonukleazės aktyvumą.Pasiekusi zondą, DNR polimerazė hidrolizuos zondą iš šablono, atskirs reporterio fluorescencinę grupę nuo gesintuvo fluorescencinės grupės ir išleis fluorescencinį signalą.Kadangi tarp zondo ir šablono yra vienas su vienu ryšys, zondo metodas yra pranašesnis už dažymo metodą bandymo tikslumo ir jautrumo požiūriu.Zondų metodas daugiausia naudojamas diagnozuojant.

K: Kas yra absoliutus kiekybinis įvertinimas?Kas yra santykinis kiekybinis įvertinimas?

Atsakymas: Absoliutus kiekybinis nustatymas reiškia pradinio mėginio, kuris turi būti tiriamas qPCR, kopijos skaičiaus apskaičiavimą, pvz., kiek HBV virusų yra 1 ml kraujo.Rezultatas, gautas atliekant santykinį kiekybinį įvertinimą, yra tikslinio geno kiekio pokytis konkrečiame mėginyje, palyginti su kitu etaloniniu mėginiu, o genų ekspresija yra reguliuojama aukštyn arba žemyn.

K: Ar RNR ekstrahavimo kiekis, atvirkštinės transkripcijos efektyvumas ir amplifikacijos efektyvumas turės įtakos eksperimento rezultatams?
Klausimas: Ar mėginių saugojimas, ekstrahavimo reagentai, atvirkštinės transkripcijos reagentai ir šviesą praleidžiančios medžiagos turės įtakos eksperimento rezultatams?
Kl .: Koks metodas gali ištaisyti eksperimentinius duomenis?

Kalbant apie šias problemas, mes jas išsamiai apibūdinsime toliau pateiktuose išplėstiniuose ir išplėstiniuose skyriuose.
2. Pažangios žinios

Kalbant apie realaus laiko fluorescencinę kiekybinę PGR, turime pripažinti realybę, kad kasmet išleidžiama tūkstančiai mokslinių tyrimų straipsnių, tarp kurių fluorescencinės kiekybinės PGR technologijos nėra mažas skaičius.

Jei nėra bendro fluorescencinio kiekybinio PGR eksperimento standarto, rezultatai gali labai skirtis.To paties tos pačios rūšies geno, naudojant tą patį apdorojimo metodą, aptikimo rezultatai taip pat labai skirsis, o vėluojantiems bus sunku pakartoti tuos pačius rezultatus.Jūs Niekas nežino, kas teisinga, o kas neteisinga.

Ar tai reiškia, kad fluorescencinė kiekybinė PGR yra apgaulės technologija ar nepatikima?Ne, taip yra todėl, kad fluorescencinė kiekybinė PGR yra jautresnė ir tikslesnė, o šiek tiek neteisinga operacija duos visiškai priešingus rezultatus.Mažas praradimas yra už tūkstančio mylių.Straipsnio autorius gali būti ne kartą kankintas recenzentų.Tuo pat metu žurnalo recenzentams taip pat sunku pasirinkti iš skirtingų eksperimentinių rezultatų.

Apskritai, tai rodo, kad realaus laiko PGR eksperimentuose nėra sutarimo.Šiuo tikslu vyresnieji pramonės mokslininkai pradėjo formuluoti standartus,reikalaujama, kad bendradarbiai straipsnyje pateiktų kai kurias būtinas eksperimentines ir duomenų apdorojimo detales (įskaitant būtinus duomenis), kad atitiktų šiuos standartus .

Recenzentai gali nuspręsti apie eksperimento kokybę skaitydami šią informaciją;būsimi skaitytojai taip pat gali tai naudoti norėdami pakartoti eksperimentą arba patobulinti eksperimentą.Tuomet tokiu būdu gauti eksperimentiniai rezultatai yra pilni informacijos, kokybiški ir tinkami naudoti.

MIBBI (minimali informacija biologiniams ir biomedicininiams tyrimams)http://www.mibbi.org) atsirado.MIBBI yra projektas, kuriame pateikiami eksperimentų standartai.Jis skelbiamas gamtoje.Šis projektas skirtas įvairiems biologiniams eksperimentams, įskaitant ląstelių biologiją, Microarray, qPCR, apie kuriuos dabar diskutuosime ir kt., ir numato kiekvieno tipo eksperimentus pateikiant rankraščius.Ši informacija turėtų būti teikiama visą laiką.

MIBBI projekte yra du straipsniai, susiję su fluorescencine kiekybine PGR, būtent:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – struktūrizuota kalba ir ataskaitų teikimo vadovas, skirtas realaus laiko kiekybiniams PGR duomenims;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PGR Experiments) – minimali informacija skelbiant straipsnius apie realaus laiko kiekybinius PGR eksperimentus.
Pirma, pakalbėkime apie RDML, terminų specifikaciją.

Jei viskam nėra standartinio apibrėžimo, diskusijos tęsti neįmanoma, todėl terminų paaiškinimas yra toks svarbus egzamine.
Fluorescencinio kiekybinio PGR eksperimente vartojama terminija apima tokį turinį.QIAGEN mums padarė geriausią santrauką.Toliau visi yra sausiprekės .

Amplifikacijos kreivė
Amplifikacijos kreivė reiškia kreivę, sudarytą PGR proceso metu, kur ciklo numeris yra abscisė, o realaus laiko fluorescencijos intensyvumas reakcijos metu yra ordinatės.

Puiki stiprinimo kreivė turėtų turėti šias charakteristikas: bazinė linija yra plokščia arba šiek tiek sumažėjusi, ir nėra akivaizdžios didėjimo tendencijos;kreivės vingio taškas yra aiškus, o eksponentinės fazės nuolydis yra proporcingas stiprinimo efektyvumui.Kuo didesnis nuolydis, tuo didesnis stiprinimo efektyvumas;bendra stiprinimo kreivė Lygiagretumas yra geras, o tai rodo, kad kiekvieno vamzdelio stiprinimo efektyvumas yra panašus;mažos koncentracijos mėginių amplifikacijos kreivės eksponentinė fazė yra akivaizdi.

Pradinė padėtis (pradinė)
Bazinis lygis yra ankstyvojo ciklo triukšmo lygis, paprastai matuojamas tarp 3 ir 15 ciklo, nes per šį laikotarpį negalima aptikti fluorescencijos vertės padidėjimo, kurį sukelia amplifikacijos produktas.Ciklų, naudojamų bazinei linijai apskaičiuoti, skaičius gali būti įvairus ir gali tekti jį sumažinti, jei naudojami dideli šablonų kiekiai arba jei tikslinio geno ekspresijos lygis yra aukštas.

Norint nustatyti bazinę liniją, reikia peržiūrėti fluorescencijos duomenis iš tiesiškumo stiprinimo kreivės.Bazinė linija nustatoma taip, kad amplifikacijos kreivės augimas prasidėtų ciklo skaičiumi, didesniu už bazinės linijos ciklo viršutinį skaičių.Kiekvienos tikslinės sekos bazinės linijos turi būti nustatytos atskirai.Vidutinės fluorescencijos vertės, nustatytos ankstyvaisiais ciklais, turi būti atimtos iš fluorescencijos verčių, gautų sustiprintuose produktuose.Naujausios įvairios realaus laiko PGR programinės įrangos versijos leidžia automatiškai optimizuoti atskirų mėginių pradinius nustatymus.

Per pirmuosius kelis PGR amplifikacijos reakcijos ciklus fluorescencinis signalas beveik nesikeičia.Priartėjimas prie tiesios linijos vadinamas bazine linija, bet jei atidžiai pažvelgsime į pirmuosius kelis ciklus, pamatysime, kad bazinėje linijoje yra tai, kas vyksta toliau pateiktame paveikslėlyje.

Fonas Fonas nurodo
nespecifinė fluorescencijos reikšmė reakcijoje.Pavyzdžiui: neefektyvus fluorescencijos gesinimas;arba daug dvigrandžių DNR šablonų dėl SYBR Green naudojimo.Foniniai signalo komponentai matematiškai pašalinami naudojant Real-Time PGR programinės įrangos algoritmą.

Reporterio signalas
Reporterio signalas reiškia fluorescencinį signalą, kurį generuoja SYBR Green arba fluorescenciniu būdu pažymėti sekos specifiniai zondai realiojo laiko PGR metu.

Normalizuotas reporterio signalas (RN)
RN reiškia reporterio dažų fluorescencijos intensyvumą, padalytą iš pasyviųjų etaloninių dažų fluorescencijos intensyvumo, išmatuoto kiekviename cikle.

Pasyvus etaloninis dažiklis
Kai kuriuose realaus laiko PGRfluorescencinis dažiklis ROX naudojamas kaip vidinė atskaitos taškas fluorescenciniam signalui normalizuoti.Jis koreguoja skirtumus, atsiradusius dėl netikslaus pipetavimo, šulinėlių padėties ir fluorescencijos svyravimų pagal kiekvieną šulinį.

Fluorescencijos slenkstis (slenkstis)
buvo pakoreguotas virš fono vertės ir žymiai žemiau amplifikacijos kreivės plato vertės.Jis turi būti tiesinėje amplifikacijos kreivės srityje, atspindinčioje logaritminį tiesinį PGR aptikimo diapazoną.Slenksčiai turėtų būti nustatyti logaritminės amplifikacijos kreivės rodinyje, kad logaritminė tiesinė PGR fazė būtų lengvai identifikuojama.Jei realaus laiko PGR yra keli tiksliniai genai, slenkstis turi būti nustatytas kiekvienam taikiniui.Paprastai pirmųjų 15 PGR reakcijos ciklų fluorescencinis signalas naudojamas kaip fluorescencinis fono signalas, o fluorescencijos slenkstis yra 10 kartų didesnis už standartinį pirmųjų 3–15 PGR ciklų fluorescencijos signalo nuokrypį, o fluorescencijos slenkstis nustatomas eksponentinės PGR amplifikacijos fazėje.Paprastai kiekvienas instrumentas turi savo fluorescencijos slenkstį, nustatytą prieš naudojant.

Ciklo slenkstis (CT) arba kirtimo taškas (CP)
Ciklas, kai stiprinimo kreivė kerta slenkstį (ty tašką, kuriame fluorescencijos aptikimas žymiai padidėja).KT gali būti trupmena ir galima apskaičiuoti pradinio šablono kiekį.CT reikšmė parodo ciklų skaičių, kai fluorescencinis signalas kiekviename PGR reakcijos mėgintuvėlyje pasiekia nustatytą slenkstį.Yra tiesinis ryšys tarp kiekvieno šablono CT reikšmės ir šablono pradinio kopijos numerio logaritmo,Kuo didesnis pradinis kopijos skaičius, tuo mažesnė CT reikšmė ir atvirkščiai.Standartinė kreivė gali būti sudaryta naudojant standartą su žinomu pradiniu kopijos numeriu, kur abscisė reiškia CT reikšmę, o ordinatės – pradinio kopijos skaičiaus logaritmą.Todėl tol, kol gaunama nežinomo mėginio CT vertė, pradinį mėginio kopijos numerį galima apskaičiuoti pagal standartinę kreivę.

ΔCT vertė
ΔCT reikšmė apibūdinaskirtumas tarp tikslinio geno ir atitinkamo endogeninio etaloninio geno KT reikšmės, pvz., namų tvarkymo genas, ir naudojamas norint normalizuoti naudojamo šablono kiekį:
⇒ΔCT = CT (taikinio genas) – CT (endogeninis etaloninis genas)

ΔΔCT vertė
ΔΔCT reikšmė apibūdina skirtumą tarp dominančio mėginio (pvz., stimuliuojamų ląstelių) vidutinės ΔΔCT vertės ir etaloninio mėginio (pvz., nestimuliuotų ląstelių) vidutinės ΔΔCT vertės.Etaloninis mėginys taip pat vadinamas kalibravimo mėginiu, o visi kiti mėginiai normalizuojami pagal tai santykiniam kiekybiniam įvertinimui:
⇒ΔΔCT = vidutinis ΔCT (dominantis pavyzdys) – vidutinis ΔCT (referencinis pavyzdys)

Endogeniniai etaloniniai genai (endogeniniai etaloniniai genai)
Endogeninių etaloninių genų, tokių kaip namų tvarkymo genai (namų tvarkymo genai), ekspresijos lygiai tarp mėginių nesiskiria.Palyginus etaloninio geno CT reikšmes su tiksliniu genu, tikslinio geno ekspresijos lygis gali būti normalizuotas pagal įvesties RNR arba cDNR kiekį (žr. skyrių apie ΔCT reikšmes aukščiau).

Tinkami vidiniai etaloniniai genaigalimas RNR skilimas arba fermentų inhibitorių buvimas RNR mėginiuose, taip pat RNR kiekio kitimai, atvirkštinės transkripcijos efektyvumas, nukleorūgščių atkūrimas ir mėginių tvarkymas.Norėdami pasirinkti optimalų (-ius) etaloninį (-ius) geną (-us), modifikavome algoritmą, kad būtų galima pasirinkti optimalią atskaitą, priklausomai nuo eksperimentinės nuostatos.

Vidinė kontrolė
Kontrolinė seka, kuri amplifikuojama toje pačioje reakcijoje kaip ir tikslinė seka ir zonduojama kitu zondu (ty atliekant dvipusę PGR).Vidiniai valdikliai dažnai naudojami siekiant atmesti nesėkmingus sustiprinimus, pavyzdžiui, kai neaptinkama tikslinė seka.
Kalibravimo pavyzdys
Etaloninis mėginys (pavyzdžiui, išgryninta RNR iš ląstelių linijos arba audinio), naudojamas santykiniam kiekybiniam įvertinimui, siekiant palyginti visus kitus mėginius, siekiant nustatyti santykinį geno ekspresijos lygį.Kalibravimo mėginys gali būti bet koks mėginys, bet paprastai yra kontrolinis (pavyzdžiui, neapdorotas mėginys arba mėginys iš eksperimento nulinio laiko).

Teigiami valdikliai
naudoti kontrolines reakcijas sužinomi šablono kiekiai.Teigiami valdikliai dažnai naudojami norint patikrinti, ar pradmenų rinkinys arba pradmenų-zondo rinkinys veikia tinkamai ir ar reakcija nustatyta tinkamai.

Nėra šablono valdymo (NTC)
Kontrolinė reakcija, kurioje yra visi būtini amplifikacijos reakcijos komponentai, išskyrus šabloną, kuris paprastai pakeičiamas vandeniu.Naudojant NTC galima rasti užterštumą, sukeltą reagento užteršimo ar svetimos DNR, taip užtikrinant aptikimo duomenų autentiškumą ir patikimumą.NTC kontrolės sustiprinimas rodo užteršimą.

Nėra RT kontrolės (NRT)
RNR ekstrahavimo procese gali būti likutinės genominės DNR, kuri yra labai kenksminga ir yra kaltininkas, turintis įtakos duomenų kokybei ir natūralus qPCR priešas, todėl planuojant eksperimentus jis turi būti sukurtas taip, kad tik sustiprintų RNR aptikimą.Yra du būdai: vienas – sukurti pradmenis tarp intronų, kitas – visiškai pašalinti DNR, kuris yra geresnis. Tai bus aptarta vėliau.NTR kontrolė yra stebuklingas veidrodis DNR užterštumui aptikti.Jei yra stiprinimas, tai reiškia, kad yra tarša.

Standartai
Standartai yra žinomos koncentracijos arba kopijų skaičiaus pavyzdžiai, naudojami standartinei kreivei sudaryti.Siekiant užtikrinti standarto stabilumą, geno fragmentas paprastai klonuojamas į plazmidę ir naudojamas kaip standartas.

Standartinė kreivė
paprastai atskiedžiamas į ne mažiau kaip 5 koncentracijos gradientus standartiniu produktu pagal padvigubinimo santykį, o 5 taškai nubrėžiami KT reikšmės ir kopijos skaičiaus koordinatėse, o taškai sujungiami taip, kad susidarytų linija, sukurianti standartinę kreivę.Kiekvienai standartinei kreivei reikia patikrinti jos galiojimą.Nuolydžio vertė yra nuo –3,3 iki –3,8, o kiekviena koncentracija atliekama trimis egzemplioriais.Taškai, kurie labai skiriasi nuo kitų taškų, turėtų būti atmesti.Tiriamo mėginio CT reikšmė įtraukiama į standartinę kreivę ir galima apskaičiuoti tiriamo mėginio išraiškos lygį.

Tiriamo mėginio CT reikšmė įtraukiama į standartinę kreivę ir galima apskaičiuoti pradinį tiriamo mėginio kopijos numerį.

Efektyvumas ir nuolydis
Standartinės kreivės nuolydis parodo realaus laiko PGR efektyvumą.
· -3,322 nuolydis rodo, kad PGR amplifikacijos efektyvumas yra 1 arba 100 % efektyvus, o PGR produkto kiekis padvigubėja per kiekvieną ciklą.
·Mažesnis nei –3,322 (pvz., –3,8) nuolydis rodo PGR efektyvumą
· Didesnis nei –3,322 (pvz., –3,0) nuolydis rodo, kad PGR efektyvumas yra didesnis nei 100%, o tai įdomu, kaip vienas PGR ciklas galėtų sukurti daugiau nei dvigubai amplifikuotą produktą?Ši situacija atsiranda netiesinėje PGR reakcijos fazėje, tai yra, yra daug nespecifinės amplifikacijos.

lydymosi kreivė
Baigus qPCR amplifikaciją, PGR produktas kaitinamas.Kylant temperatūrai, dvigrandė amplifikacijos produktas palaipsniui tirpsta, todėl fluorescencijos intensyvumas mažėja.Pasiekus tam tikrą temperatūrą (Tm), išsilydys daug produktų.Fluorescencija smarkiai sumažėja.Skirtingi PGR produktai turi skirtingas Tm vertes ir skirtingas lydymosi temperatūras, todėl galima nustatyti PGR specifiškumą.

Lydymosi kreivė (išvestinė kreivė)
Lydymosi kreivė gaunama siekiant sudaryti smailių žemėlapį, kuris gali intuityviau parodyti PGR produkto fragmentų situaciją.Kadangi lydymosi temperatūra yra DNR fragmento Tm reikšmė, galima spręsti apie kai kuriuos parametrus, turinčius įtakos DNR fragmento Tm vertei, pvz., fragmento dydį, GC kiekį ir tt. Paprastai tariant, pagal mūsų pradmenų projektavimo principus,amplifikuoto produkto ilgis yra 80-300 bp diapazone, todėl lydymosi temperatūra turi būti nuo 80°C iki 90°C.

Lydymosi kreivės interpretacija: Jei vienintelė pagrindinė smailė atsiranda tarp 80°C–90°C, tai reiškia, kad fluorescencinė kiekybinė PGR yra tobula;jei pagrindinė smailė atsiranda tarp 80 °C–90 °C, o įvairios smailės atsiranda žemiau 80 °C, iš esmės atsižvelgiama į pradmenų dimerį.Norėdami tai išspręsti, galite pabandyti padidinti atkaitinimo temperatūrą;jei pagrindinė smailė atsiranda tarp 80°C-90°C, o kita smailė vėl atsiranda pakilus temperatūrai, iš esmės manoma, kad yra DNR užterštumas, todėl DNR reikia pašalinti pradiniame eksperimento etape.

Žinoma, vis dar yra nenormalių situacijų, kurios bus suskirstytos po vieną žemiau.
3. Pažangios žinios

Norėdami atlikti qPCR, turiu pasakyti MIQE,Minimali informacijaPaskelbimuiKiekybinisRealaus laiko PGREksperimentai – minimali informacija skelbiant straipsnius apie realaus laiko kiekybinę PGReksperimentai.Siekdami supaprastinti visų supratimą, supaprastinsime pagrindinį turinį.

Originalaus MIQE teksto galite ieškoti internete, o svarbiausia, kad jame būtų nurodytaduomenų kontrolinis sąrašas, kurį reikia pateikti publikuojant straipsnį .

Recenzentai gali nuspręsti apie eksperimento kokybę skaitydami šią informaciją;būsimi skaitytojai taip pat gali tai panaudoti eksperimentui pakartoti arba tobulinti.
Verta paminėti, kad šiame sąraše kiekvieno sąrašo svarba atitinkamai pažymėta E arba D.Ką tai reiškia?E: esminė informacija (būtina pateikti);D: pageidaujama informacija (pateikite kiek įmanoma daugiau).

MIQE (1) – eksperimentinis dizainas
Daugelis niekšų, baigusių gynimą baigę magistrantūros studijas, nemokės savarankiškai suplanuoti eksperimento, atsidaryti sąsiuvinių ir daryti tai, ką liepia mokytojas.Dėl to eksperimentinis dizainas nebuvo griežtas, o žurnalo redakcija pasakė, kad norėjo padaryti šią nuotrauką ir tą paveikslėlį, todėl jie tai padarė apsvaigę.Štai kaip gaminami niekšai!

Arčiau namų pirmasis eksperimento principas yra nustatytieksperimentinės logikos griežtumas.Svarbiausias dalykas yra eksperimentinis planas, o svarbiausias dalykas, susijęs su eksperimentiniu planu, yra tai, kaip nustatyti tikslinį mėginį, etaloninį pavyzdį (kontrolę) ir pakartojimų skaičių, kad eksperimentiniai duomenys būtų referenciniai, palyginami ir įtikinami.

Tikslinis pavyzdysreiškia mėginį, kuriam po tam tikro gydymo reikia aptikti tikslinį geną.Referencinis pavyzdysyra mėginys be jokio apdorojimo, kuris biologijoje dažnai vadinamas laukiniu tipu.

Eksperimentiniai pakartojimaiyra labai svarbūs.Paprastai įtikinamų pakartojimų skaičius turi būti didesnis nei trys.Būtina atskirti, kas yra biologinė replikacija, o kas – techninė replikacija.

Biologiniai pakartojimai: Tas pats patikros eksperimentas atliktas su skirtingomis medžiagomis (laiku, augalais, partijomis, reakcijos plokštelėmis).

Biologinis dubliavimasis
Kaip pavyzdį paimkime pipirų apdorojimą pesticidais.Mes norime purkšti pesticidais tris ABC augalus, tada trys ABC augalai yra trys biologiniai pakartojimai, ir tai yra tas pats patikrinimo eksperimentas, atliktas su skirtingomis medžiagomis.Bet kaip eksperimentą, būtinai reikalinga kontrolė, todėl galime purkšti vieną iš augalo A šakų, kad susidarytų eksperimentinė augalo A grupė, o nepurkšti kitų augalo A šakų, kad susidarytų kontrolinė grupė.Tą patį padarykite su B ir C.

Techninės kopijos (techninės kopijos): Tai pakartotinis eksperimentas, skirtas išvengti klaidų, atsirandančių dėl operacijos, kuri iš tikrųjų yra toje pačioje medžiagoje esanti skylė.Tiek gydymo, tiek kontrolinių mėginių nustatymai turi būti pakartojami (ne mažiau kaip trys) tikslinio geno ir vidinio etaloninio geno.

Techninis pakartojimas
Kaip pavyzdį vėl imkite pesticidais apdorotą pipirą.Eksperimentinei augalų A grupei padarėme tris PGR skylutes po 1, 2 ir 3 atitinkamai tiksliniam genui ir vidiniam etaloniniam genui, kad po aptikimo gautume vidurkį.A augalo kontrolei grupės taip pat traktuojamos taip pat.Panašiai apdorokite B ir C augalus.Tai techninis pakartojimas.

Verta pažymėti, kadį statistiką patenka biologinis pasikartojimas, o techninis pakartojimas yra patikrinti, ar eksperimento procese nėra atsitiktinių reiškinių, kad eksperimento rezultatai būtų patikimi, tai yra, kad būtų išvengta klaidų, imant jų vidurkį, kaip dažnai sakome.

Neigiamos kontrolės priemonės – NTC ir NRT
NTC (kontrolė be šablono), kontrolė be šablono, naudojama patikrinti, ar eksperimentinė medžiaga yra užteršta.Paprastai vanduo naudojamas kaip šablonas.Jei yra fluorescencinė reakcija, tai rodo, kad laboratorijoje įvyko užteršimas nukleino rūgštimis.

Šios taršos kyla iš: nešvaraus vandens, nekvalifikuotų reagentų, kuriuose yra endogeninės DNR, pradmenų užterštumo, laboratorinės įrangos užterštumo, aerozolių užterštumo ir kt., Reikia naudoti RNazės valymo priemones ir RNazės inhibitorius.Sunkiausia rasti aerozolinę taršą.Įsivaizduokite, kad jūsų laboratorija yra tarsi smogas, o ore pakimba įvairios nukleino rūgštys.

NRT (be atvirkštinės transkriptazės), kontrolė be atvirkštinės transkripcijos, yra ne atvirkštinė transkribuota RNR kaip neigiama kontrolė, kuri yra gDNR liekanos kontrolė.

Atliekant genų ekspresiją, RNR kiekis nustatomas nustatant cDNR kiekį po atvirkštinės transkripcijos.Jei išvalius RNR yra gDNR liekanų, tai sukels klaidų eksperimento rezultatuose, nes faktiniai gauti rezultatai yra gDNR ir cDNR.Agregatiniu lygiu, o ne tik cDNR, gDNR turi būti visiškai pašalinta RNR ekstrahavimo metu.

MIQE (2) – informacijos pavyzdys
Vadinamoji pavyzdinė informacija reiškia, kad kai skelbiame straipsnį apie qPCR, turime aiškiai paaiškinti pavyzdinę informaciją, kuri yra nepakeičiama straipsnio dalis.Panašiai, kai apdorojame mėginius, taip pat turime reguliuoti savo operacijas, kad užtikrintume mėginių galiojimą.

Mėginio aprašymas yra tik rezultatas, todėl turėtume daugiau dėmesio skirti viso eksperimento metu paimtoms medžiagoms.

Eksperimentinių medžiagų parinkimas
Kraujo mėginiai – rinkitės šviežią kraują, ne ilgiau kaip 4 val.Ląstelių mėginiai – pasirinkite rinkti šviežias ląsteles intensyvaus augimo laikotarpiu.Gyvūninis audinys – rinkitės šviežią, energingai augantį audinį.Augalinis audinys – rinkitės šviežią, jauną audinį.

Turbūt pastebėjote, kad šiuose keliuose sakiniuose yra raktinis žodis: šviežias .
Pirmiau minėtiems mėginiams geriausias, ekonomiškiausias ir stabilus rinkinys rinkoje yra Foregene rinkinys, kuris gali greitai ir lengvai išgauti jų DNR ir RNR.

Kraujo DNR mini rinkinys

Ląstelių bendros RNR izoliacijos rinkinys

Gyvūnų bendros RNR izoliacijos rinkinys

Augalų bendros RNR izoliacijos rinkinys

Plant Total RNR izoliacijos rinkinys plius

Augalų DNR izoliavimo rinkinys

Eksperimentinių medžiagų saugojimas
Apskritai, jei leidžia sąlygos, mes nerekomenduojame laikyti mėginių.Tačiau yra daug draugų, kurie negali atlikti eksperimentų iš karto po mėginių paėmimo, o kai kuriems net reikia neštis skysto azoto bakus į lauką paimti mėginius.

Tokiam darbščiam draugui galiu pasakyti tik tiek, kad jūs nesuprantate reagentų eksploatacinių medžiagų.Dabar daugelis reagentų vartojimo įmonių gamina reagentus, kurie gali laikyti RNR mėginius kambario temperatūroje, ir jūs galite pasirinkti juos naudoti.Įprastas laikymo būdas yra skysto azoto saugojimas, naudojant mažą skysto azoto baką, kurį lengva neštis.Grąžinus mėginį į laboratoriją, laikykite jį -80°C šaldytuve.

Atliekant eksperimentus su RNR, reikia vadovautis šešių žodžių principu:žema temperatūra, be fermentų,irgreitai .

Žemos temperatūros sąvoką lengva suprasti;be fermentų RNazė yra visame pasaulyje, kuriame gyvename (kitaip būtumėte nužudyti nuo ŽIV), todėl kaip išvengti RNazės atliekant eksperimentus yra labai svarbi sąvoka;greitai,Pasaulyje nėra Kung Fu, kurio nebūtų galima palaužti, tik greitis negali būti sulaužytas.

Todėl tam tikra prasme kuo trumpesnis ištraukimo laikas, tuo geresnis rinkinys.Kodėl taipForegenerinkinys pabrėžia greitį, nes jie tai gerai žino.

PS: Kai kurios merginos eksperimentus atlieka labai atsargiai, bet po kelerių metų darbo jie nėra tokie geri, kaip „slam dunk“.Jie mano, kad Dievas yra neteisingas, skundžiasi kitais ir ieško gyvenimo.Tiesą sakant, ji to nesuprato.Jis gerai neapsaugojo RNR, o „slam dunk“ žaidėjas buvo vikrus.Atlikdamas eksperimentą jis manė, kad „slam dunk“ užbaigs trimis, penkiais ir dviem padalijimais, tačiau eksperimentą atliko gerai.

Pastaba: lėtesnė, didesnė RNazės invazijos tikimybė.Kaip išmokyti save būti greitu?Jokiu būdu negalima, tiesiog daugiau praktikuokite.

Skirtingiems eksperimentams ir skirtingiems pavyzdžiams vis tiek reikia perskaityti daugiau literatūros ir pasirinkti tinkamą apdorojimo būdą.Mėginių paėmimo ir saugojimo procese MIQE reikalauja, kad tai būtų aiškiai parašyta darbe, kad recenzentai galėtų įvertinti darbo patikimumą, o apstulbusiems jaunuoliams būtų patogu pakartoti jūsų eksperimentą.

Nors biologiniai eksperimentai yra sunkūs, jie yra aukščiausios klasės.Jei nesate atsargūs, galite apversti pasaulį.Pavyzdžiui, SARS pavertimas biochemine krize arba hibridinių ryžių gamyba, siekiant išgelbėti 1,3 mlrd. žmonių.Žemiau esančiame paveikslėlyje parodytas cheminis eksperimentas. Turėtumėte suprasti, kaip didžiuojatės savo tyrimu, vien pažvelgę ​​į jo penį primenančią išvaizdą.Pamiršk tai, nejuodink jo.

MIQE (3) – nukleorūgščių ekstrahavimas.
Nukleino rūgščių ekstrahavimas yra didelis įvykis, o visi molekulinės biologijos eksperimentai prasideda nuo nukleorūgščių ekstrahavimo.Visų pirma, nukopijuokime MIQE turinį apie nukleino rūgščių ekstrakciją.

Žiūrėdami į šią formą, negalite likti paviršiuje.Forma yra dogma.Norėdami būti geriausiu studentu, turite paklausti, kodėl.Esminis šios lentelės turinys: SiektiRNR grynumas, vientisumas, konsistencija ir ekstrahavimo kiekis .

Pirmoji dalisprocesas arba instrumentas yra nukleorūgščių ekstrahavimo etapas.Jei ekstrahavimui naudojate automatinį nukleorūgščių ekstraktorių (pažangus, susisiekite su manimi dėl pirkimo), turite nurodyti prietaiso modelio pavadinimą.

Rinkinio pavadinimas ir

koks rinkinys buvo naudojamas pakeitimo detalėms, kokie specialūs reagentai buvo pridėti arba kokios specialios operacijos buvo atliktos, turėtų būti aiškiai paaiškinta, kad kiti galėtų lengvai pakartoti jūsų eksperimentą.

Kai kurie žmonės, ekstrahuodami specialius mėginius, prideda kokių nors specialių reagentų, manydami, kad tai yra jų slaptas ginklas, ir nesakys kitiems.Saugodami tai paslaptyje, jie taip pat praranda galimybę padaryti jūsų straipsnį spindesį.Nebūk gudrus, moksliniuose tyrimuose turi būti sąžiningesnis už senąjį Zhangą, jei nori būti protingas, straipsnis padarys tave kvailu.

turi atsiminti rinkinio gaminio numerįkai užsisakysite rinkinį ir parašykite straipsnį .Paprastai ant rinkinio yra du skaičiai: Cat – katalogo numeris (produkto numeris, gaminio numeris), Partija – gaminio partijos numeris (naudojamas norint nurodyti, iš kurios partijos buvo gautas produktas).

Be to, dažnai užsakant biocheminius reagentus naudojamas CAS numeris, kurį kartu populiarinsiu.CAS numeris yra Amerikos chemijos draugijos suteiktas numeris kiekvienam naujam cheminiam vaistui.Paprastai trys skaičiai yra sujungti brūkšneliu.Rushui CAS numeris: 7732-18-5.Cheminės medžiagos dažnai turi kelis slapyvardžius, tačiau CAS numeris yra unikalus.Užsakydami vaistą, pirmiausia galite patikrinti jo CAS numerį.

Arčiau namų, kodėl turime šiuos dalykus aiškiai apibūdinti?Tiesą sakant, tai taip pat yra RNR ekstrahavimo kokybės patikrinimas.Naudojant prietaisus ir rinkinius, RNR ekstrahavimas bus nuoseklesnis.Paprastų laboratorijų gavybos mastas nėra didelis, jį galima gauti su rinkiniais.

Išsami informacija apie gydymą DNaze arba RNase
Svarbus fluorescencinės kiekybinės PGR klausimas yra užkirsti kelią DNR užteršimui ir neeksperimentuoti, jei yra užterštumas.Todėl būtina nurodyti procesą, kurį naudojote DNR apdoroti, kad parodytumėte, jog eksperimentinio proceso DNR buvo visiškai ir visiškai pašalinta.pavaizduota schema.

Scheminė RNR ir DNR diagrama
Paprastai DNR pašalinimo būdas yra RNR apdorojimas DNaze po ekstrahavimo.Tačiau tai gana seni metodai.Komerciniai RNR ekstrahavimo rinkiniai galėjo pašalinti DNR ekstrahavimo proceso metu nepridedant DNazės.Pavyzdžiui, rinkinių iš Foregene serija.

Pastaba: DNR pašalinimas RNR išskyrimo metu yra labai pavojingas dviašmenis kardas, kuris prailgins RNR išskyrimo veikimo laiką ir padidins RNR degradacijos riziką.Iš esmės tai yra kompromisas tarp RNR derlingumo ir grynumo.

Be to, į silicio dioksido pagrindu pagamintą adsorbcijos kolonėlę dedama DNazės kiekis yra labai mažas, o norint pasiekti efektą, reikia naudoti aukštos kokybės DNazę.Neoptimizuotos DNazės negalima greitai ir visiškai suvirškinti.Tai prekybininko techninio lygio patikrinimas.Žinoma, yra ir dar keistesnių prekeivių, kurie giriasi, kad DNR galima pašalinti be DNazės.Galima sakyti, kad kiekvienas, kuris giriasi, kad DNR gali būti visiškai pašalinta be DNazės, yra chuliganas.DNR yra gana stabili dvigrandė struktūra, kurios negalima nušluoti vien kalbant ir juokiantis.

Užterštumo įvertinimas
vertinimo metodas: elektroforezės aptikimas, 1% agarozės, 6V/cm, 15min, pakrovimas 1-3 ul

Nukleino rūgščių kiekybinė analizė
dažniausiai matuojamas UV spektrofotometru.Pirmiausia leiskite man išpopuliarinti trijų verčių OD260, OD280 ir OD230 reikšmę.
·OD260nm: Tai didžiausios nukleino rūgšties absorbcijos smailės sugerties bangos ilgis, o geriausia išmatuota vertė svyruoja nuo 0,1 iki 1,0.Jei ne, praskieskite arba koncentruokite mėginį, kad jis atitiktų diapazoną.
·OD280nm: Tai didžiausios baltymų ir fenolinių medžiagų absorbcijos smailės sugerties bangos ilgis.
·OD230nm: tai didžiausios angliavandenių absorbcijos smailės sugerties bangos ilgis.

Toliau pakalbėkime apie kiekvieno rodiklio vaidmenį.A260 atveju jis gali būti naudojamas nukleino rūgšties kiekiui matuoti.Kai OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNR=40μg/ml.

Dėl grynumo turime pažvelgti į dažniausiai matomus santykius: OD260/280 ir OD260/230.
·Gryna DNR: OD260/280 yra maždaug lygus 1,8.Kai jis didesnis nei 1,9, tai rodo, kad yra RNR tarša, o kai mažesnė nei 1,6, tai rodo, kad yra baltymų ir fenolių užterštumas.
·Gryna RNR: 1.7
·OD260/230: nesvarbu, ar tai DNR, ar RNR, pamatinė vertė yra 2,5.Kai jis mažesnis nei 2,0, tai rodo, kad yra užterštumas cukrumi, druska ir organinėmis medžiagomis.

RNR vientisumas

Labai svarbu išmatuoti RNR vientisumą.Paprastai, norint patikrinti, ar ryškumas tarp 28S ir 18S RNR yra dvigubas ryšys, būtina atlikti RNR denatūravimo gelio eksperimentą.Kai atsiranda trečioji juosta 5S, tai reiškia, kad RNR pradėjo irti, išskyrus bestuburius.

Duomenys RNR kokybei įvertinti: be pirmiau minėtų testų, yra ir keletas pažangesnių instrumentinių tyrimų, susijusių su RNR vientisumu, pavyzdžiui, Experion automatinės elektroforezės sistemos RQI vientisumo testas, kuris gali nustatyti, ar RNR nepastebimai suyra.

Moksliniuose tyrimuose fluorescencinė kiekybinė PGR yra tikslinio geno ir vidinio etaloninio geno palyginimas.Todėl RNR mėginio konservavimo, RNR ekstrahavimo ir kt. procese pagrindinis tikslas yra užtikrinti RNR vientisumą.

Kaip RNR vientisumas veikia pusiausvyrą tarp tikslinio geno ir vidinio etaloninio geno, galima lengvai suprasti iš toliau pateikto paveikslo.Degradacija sukels geno neužbaigtumą, nesvarbu, ar tai būtų vidinio etaloninio geno neužbaigtumas, ar tikslinio geno neužbaigtumas, tai turės didelę įtaką duomenims.

Tikslinio geno ir etaloninio geno schema neturi būti teisinga

Slopinimo testas (ar KT reikšmė slopinama esant didelei ar žemai koncentracijai ar kitomis sąlygomis)

Atsižvelgiant į šį paveikslą kaip pavyzdį, penkių kreivių Ct reikšmės yra tokios.CT verčių pasiskirstymas tarp kreivių yra netolygus, o esant didelėms ir mažoms koncentracijoms, Ct reikšmės vėluoja, o tai yra PGR slopinimo atveju.

Pagrindinis dalykas: RNR ekstrahavimo procese turime atsisakyti klaidingų nuomonių ir nustatyti teisingas.

Klaidinga mintis yra tokia: RNR ekstrahavimas tik siekia išeigos, manydamas, kad kuo didesnis RNR kiekis, tuo geriau.Tiesą sakant, kai atliekame kiekybinį įvertinimą, jei genų skaičius nėra labai didelis, mums nereikia daug RNR.Išgautos RNR kiekis yra daugiau nei pakankamas.

Teisinga koncepcija yra tokia:RNR ekstrahavimas turėtų būti grynas, vientisas ir nuoseklus.Grynumas gali užtikrinti, kad vėlesnė atvirkštinė transkripcija nebus slopinama ir duomenų nepaveiks DNR.Vientisumas užtikrina tikslinių sekų ir vidinių nuorodų pusiausvyrą.Konsistencija užtikrina stabilų mėginio įkėlimą.

MIQE (4) – atvirkštinė transkripcija
Klaidingas supratimas: didesnio mėginio kiekio siekimas.
Teisinga koncepcija: Siekti nuoseklumo (stabilumo), nepaisant įkeltos RNR kiekio, atvirkštinės transkripcijos efektyvumas išlieka pastovus, užtikrinant, kad cDNR skirtumai tikrai atspindėtų mRNR skirtumus.
Šį procesą paaiškiname schematiškai:

Scheminė atvirkštinės transkripcijos efektyvumo diagrama nėra tiesa
Visų pirma, turime suprasti skirtumą tarp atvirkštinės transkripcijos proceso ir PGR proceso.PGR vyksta daug kaitinimo ir atkaitinimo procesų, o tikslinis fragmentas auga eksponentiškai;Nors atvirkštinė transkripcija nevykdo šio proceso, galime įsivaizduoti, kad atvirkštinė transkripcija iš tikrųjų yra vienas su vienu Replikacijos proceso metu tiek daug RNR dalių

kadangi yra galima gauti kuo daugiau cDNR informacijos gabalėlių, tai jau dabar reikėtų suprasti, nes dideli ir maži fragmentai buvo perrašyti atvirkštiniu būdu, o fokusuoti į vieną fragmentą neįmanoma.O kadangi RNR kiekis yra santykinai mažas, gaunamas cDNR kiekis taip pat yra palyginti mažas, skirtingai nei PGR, kuris turi amplifikacinį efektą, todėl jo aptikti iš esmės neįmanoma.

cDNR elektroforezės rezultatai
Antra, idealiu atveju atvirkštinė transkripcija atliekama „vienas su vienu“, tačiau jokia atvirkštinė transkriptazė negali pasiekti šio efekto.Iš esmės daugumos atvirkštinių transkriptazių efektyvumas svyruoja tarp 30–50%.Jei taip yra, mes norėtume turėti gana stabilų atvirkštinės transkripcijos efektyvumą, kurį norime matyti paveikslėlyje: 3 RNR gauna 2 cDNR, 6 RNR gauna 4 cDNR, taigi, nesvarbu, kiek mėginio įkeliama, atvirkštinės transkripcijos efektyvumas yra gana stabilus.Nenorime matyti situacijos, kai atvirkštinės transkripcijos efektyvumas yra nestabilus ir didelė koncentracija slopinama.

Taigi, kaip patikrinti, ar atvirkštinės transkripcijos efektyvumas yra stabilus?Metodas labai paprastas, tereikia atlikti palyginimo testą: vienas yra atvirkštinis transkribavimas į cDNR po dvigubo RNR praskiedimo, o kitas – dvigubai praskiedus po atvirkštinio transkribavimo į cDNR, o tada atlikti qPGR, kad pamatytumėte gautą nuolydį.Kaip geriausias studentas, turėtumėte tai suprasti per kelias sekundes.Kaip parodyta žemiau:

RNR ir cDNR skiedimas, siekiant patikrinti, ar atvirkštinės transkripcijos efektyvumas yra stabilus
Atvirkštinė transkriptazė ir rinkinys
Kaip tobula fluorescencinė kiekybinė PGR gali turėti puikią atvirkštinę transkriptazę ir rinkinį.Atvirkštinė transkriptazė apytiksliai skirstoma į du tipus pagal šaltinį – AMV arbaM-MLV, o jų našumas yra toks pat, kaip parodyta lentelėje.

RNazės H aktyvumas
RNazė H yra ribonukleazė H, kiniškas pavadinimas yra ribonukleazė H, kuri yra endoribonukleazė, galinti specifiškai hidrolizuoti RNR DNR-RNR hibridinėje grandinėje.RNazė H negali hidrolizuoti fosfodiesterio jungčių viengrandėje arba dvigrandėje DNR arba RNR, tai yra, ji negali virškinti viengrandės arba dvigrandės DNR ar RNR.Dažniausiai naudojamas antrosios cDNR grandinės sintezei.

Tai keistas dalykas.Sakome, kad atvirkštinė transkriptazė turi RNazės H aktyvumą, o ne atvirkštinė transkriptazė turi RNazės H, todėl gali būti neįmanoma atskirti RNazės H nuo atvirkštinės transkriptazės, galbūt dėl ​​tam tikrų grupių konformacijos atvirkštinėje transkriptazėje. Šį aktyvumą sukelia atvirkštinė transkriptazė.

Todėl, nepaisant didesnio AMV atvirkštinės transkripcijos efektyvumo, jo RNazės H aktyvumas sumažina cDNR išeigą.Žinoma, reagentų gamintojai nuolat optimizuoja savo produktus, kad kuo labiau pašalintų RNazės H aktyvumą atvirkštinėje transkriptazėje, kad padidėtų cDNR išeiga.
Atkaitinimo temperatūra

Antrinė RNR struktūra esant skirtingoms temperatūroms
Žiūrėkite aukščiau pateiktą paveikslėlį, kuriame parodyta antrinė RNR struktūra skirtingomis temperatūromis, ir naudokite internetinį įrankį mFold, kad nustatytumėte tikslinio fragmento antrinę struktūrą konkrečiomis temperatūros ir druskos koncentracijos sąlygomis.55 ° C temperatūroje antrinė RNR struktūra vis dar yra labai sudėtinga, atvirkštinė transkriptazė negali veikti, o antrinė struktūra negali būti visiškai išspręsta iki 65 ° C, o optimali AMV ir M-MLV temperatūra yra daug žemesnė už šią temperatūrą.
ką daryti?Antrinė struktūra yra papildomas paties šablono poravimas, dėl kurio atsiranda stipri konkurencija tarp pradmenų ir atvirkštinės transkriptazės bei šablono, todėl kyla daugybė problemų, tokių kaip mažas E ir prastas pakartojamumas.

ką daryti?Tik kiek įmanoma padidinkite atkaitinimo temperatūrą.

Daugelis reagentų gamintojų tobulina savo atvirkštinę transkriptazę taikydami genų inžineriją.Kai kurie padidina reakcijos temperatūrą, pavyzdžiui, Jifan ir Aidelai, o kai kurie pašalina aktyviąją RNazės H fermento grupę, kad pagerintų afinitetą tarp fermento ir RNR šablono.Didelis giminingumas gali konkurencingai išspausti antrinę struktūrą ir sklandžiai skaityti, taip pat labai pagerinti atvirkštinės transkripcijos efektyvumą.
Pagrindinis dalykas: atvirkštinė transkripcija yra svarbiau siekiant atvirkštinės transkripcijos efektyvumo nuoseklumo (fermentai turi būti ne tik veiksmingi, bet ir stabilūs), o ne įkeliamo mėginio kiekis, jei tai nėra ypač didelio masto fluorescencinė kiekybinė PGR, tai iš viso nebus įmanoma.Kelios cDNR.
Įvairūs gamintojai taip pat dėjo pastangas siekdami nuoseklumo.Pavyzdžiui, dauguma įmonių dabar supakavo atvirkštinę transkripciją kaip standartinį parduodamų rinkinį, o tai yra geras pasirinkimas.
Pavyzdžiui, Foregene RT Easy Series rinkiniai:

RT Easy I (pagrindinis premiksas pirmosios krypties cDNR sintezės rinkiniui)

MIQE (5) – tikslinio geno informacija

Aukščiau pateiktame paveikslėlyje paaiškinama
1. Ar šis genas yra veiksmingas atliekant pakartotinius eksperimentus, paprastai galima patikrinti pakartotiniais eksperimentais.
2. Geno ID, žinote.
3. Geno ilgis, bendras tikslinio geno ilgis tikrai nėra problema.Kurdami pradmenis, įsitikinkite, kad amplikono ilgis yra nuo 80 iki 200 bp, kad būtų užtikrintas geresnis stiprinimo efektyvumas.
4. Sequence Blast palyginimo informacija, tikslinį geną reikia palyginti genų banke, kad būtų išvengta nespecifinės amplifikacijos.
5. Pseudogenų buvimas.Pseudogenas yra DNR seka, panaši į įprastą geną, bet praranda normalią funkciją.Jis dažnai egzistuoja kelių genų eukariotų šeimoje.Paprastai jis žymimas ψ.Tai nefunkcinė genomo DNR kopija genome, labai panaši į koduojančią genų seką., paprastai nėra transkribuojami ir neturi aiškios fiziologinės reikšmės.
6. Pradmenų padėtis egzonų ir intronų atžvilgiu.Pirmaisiais metais, kai sprendėme DNR užteršimo problemą, dažnai atkreipėme dėmesį į pradmenų, egzonų ir intronų padėtis ir paprastai svarstėme apie pradmenų projektavimą tarp intronų, kad išvengtume DNR amplifikacijos.Žiūrėkite paveikslėlį žemiau: juoda žymi intronus, įvairūs mėlyni – egzonus, rožinė – įprastus pradmenis, o ryškiai raudona – intronus apimančius pradmenis.

Schema, niekada netiesa
Atrodo, koks puikus planas, bet iš tikrųjų daugeliu atvejų trans-intronų pradmenys nėra tokie stebuklingi, kaip įsivaizduojama, ir jie taip pat sukels nespecifinį stiprinimą.Taigi geriausias būdas išvengti DNR užteršimo yra visiškai pašalinti DNR.
7. Konformacijos numatymas.Dar kartą naudodamiesi šiuo pavyzdžiu, naudokite internetinį įrankį mFold, kad nustatytumėte antrinę tikslinio fragmento struktūrą esant tam tikrai temperatūrai ir druskos koncentracijai.

Antrinė RNR struktūra esant skirtingoms temperatūroms
Antrinė struktūra yra papildomas paties šablono poravimas, dėl kurio pradmenys ir šablono poros sukels stiprią konkurenciją, o pradmenų surišimo tikimybė yra mažesnė, todėl atsiranda daugybė problemų, tokių kaip mažas E ir prastas pakartojamumas.Naudojant programinės įrangos numatymą, jei nėra antrinės struktūros problemos, tai būtų puiku.Jei yra, mūsų tolesniame straipsnyje bus konkrečiai aptarta, kaip išspręsti šią problemą.

MIQE (6) – qPCR oligonukleotidai

Fluorescencinės kiekybinės PGR atveju pirmas dalykas, su kuriuo kovojate kiekvieną dieną, yra RNR ekstrahavimas, o antras dalykas gali būti pradmenų dizainas.
Visų pirma, mes vis tiek patikriname taisykles dėl grunto projektavimo pagal MIQE kontrolinį sąrašą.Taip paprasta, kad niekšai gali juoktis, o mes galime užbaigti vienu sakiniu: išsiaiškinkite pradmenų zondo seką ir padėtį bei modifikavimo būdą.Pradmenų gryninimo metodui pradmenų sintezė šiuo metu yra tokia pigi, qPCR verta PAGE ir aukštesnių gryninimo metodų, o sintezės instrumento informacija nėra svarbi.Daugelis žmonių jau dešimtmečius daro pradmenis ir nežino, kad sintezatorius yra ABI3900.
Kalbant apie gruntų projektavimo principus, nereikia jų mintinai įsiminti, nes dauguma gruntų projektavimo programinės įrangos ar internetinių įrankių gali išspręsti šias problemas (rekomenduojamas internetinis įrankis primer3.ut.ee/), o 99,999% gruntų projektavimo nedaroma rankiniu būdu Pažiūrėkite, autorė kartais sukuria šimtus gruntų per dieną, jei perskaitysite po vieną.
Sukūrę gruntus, tiesiog patikrinkite šiuos dalykus:
1. Projektuoti pradmenis arti 3′ galo: kai cDNR pirmosios grandinės sintezei naudojami oligo dT pradmenys, atsižvelgiant į atvirkštinės transkripcijos efektyvumą ir RNR vientisumą, suprojektuoti pradmenys turi būti suprojektuoti arti 3′ galo, kad būtų pagerintas amplifikacijos efektyvumas.Naudokite paveikslėlį, kad paaiškintumėte taip (to neįmanoma suprasti):

Kodėl gruntai turi būti projektuojami arti 3′ galo, tai neturi būti tiesa
2. TM reikšmė: Tm reikšmė yra 55-65°C (nes egzonukleazės aktyvumas didžiausias esant 60°C), o GC kiekis yra 40%-60%.
3. BLAST: Siekiant išvengti nespecifinio genomo amplifikacijos, papildomai patikrai reikia naudoti Blast.

MIQE(7) – qPCR procesas

1. qPCR rinkinys
Pagal MIQE reikalavimus, straipsnyje turime aiškiai aprašyti visas reakcijos sąlygas, įskaitant PGR reakcijos sistemos konfigūraciją, koks rinkinys naudojamas, kas yra gamintojas, kokio dydžio yra reakcijos sistema, ar naudojamas dažymo metodas, ar zondo metodas, PGR programos parametrai.Vairuotojai veteranai tikrai pastebės, kad tol, kol rinkinys yra pasirinktas, aukščiau pateikta informacija yra iš esmės nustatyta.
Šiuo metu fluorescencinių kiekybinių PGR rinkinių gamyba ir gamyba yra labai brandi technologija.Kol nesirenkate itin prastų gamintojų, problemų tikimybė nėra didelė, tačiau vis tiek norime su Jumis pasidalinti keliais punktais:
Karštas paleidimo Taq fermentas:Svarbiausia PGR dalis yra karšto paleidimo Taq fermentas.Rinkoje esantys karšto paleidimo fermentai paprastai skirstomi į du tipus: vienas yra chemiškai modifikuotas karšto paleidimo fermentas (galite įsivaizduoti kaip parafino įterpimą), o kitas yra karšto paleidimo fermentas, skirtas antikūnų modifikavimui (antigeno ir antikūnų surišimui).Cheminis modifikavimas yra ankstyvas fermentų karšto paleidimo būdas.Kai pasiekiama tam tikra temperatūra, fermentas išlaisvins savo veiklą.Antikūnais modifikuotas karšto paleidimo fermentas naudoja biologinius metodus, kad blokuotų fermento aktyvumą.Pasiekus tam tikrą temperatūrą, antikūnas bus denatūruotas ir inaktyvuotas kaip baltymas, o fermento veikla pradės veikti.

Tačiau kokia iš to nauda?Taip yra, antikūnais modifikuotų fermentų atpalaidavimo aktyvumas yra greitesnis nei chemiškai modifikuotų fermentų, todėl jautrumo požiūriu antikūnais modifikuoti fermentai turi nedidelį pranašumą, todėl rinkoje esančiuose rinkiniuose chemiškai modifikuotų fermentų iš esmės nėra.Jei yra, tai šio gamintojo technologija vis dar įstrigo tūkstantmečio epochoje.
Magnio jonų koncentracija:PGR reakcijoje labai svarbi magnio jonų koncentracija.Tinkama magnio jonų koncentracija gali paskatinti Taq fermento aktyvumo išsiskyrimą.Jei koncentracija per maža, fermento aktyvumas gerokai sumažės;jei koncentracija per didelė, sustiprės fermentų katalizuojama nespecifinė amplifikacija.Magnio jonų koncentracija taip pat turės įtakos pradmenų atkaitinimui, šablono ir PGR produktų lydymosi temperatūrai, todėl paveiks amplifikuotų fragmentų išeigą.Magnio jonų koncentracija paprastai kontroliuojama 25 mM.Žinoma, kad rinkinys būtų geras, magnio jonų koncentracija turi būti gerai kontroliuojama.Kai kurie prekybininkai į reagentą įdeda magnio jonų kompleksono, kuris gali pasiekti automatinio magnio jonų koncentracijos reguliavimo efektą.
Fluorescencinių dažų koncentracija:Fluorescencinis dažiklis, kuris yra SYBR Green, kurį dažniausiai naudojame, daugiausia generuoja fluorescenciją, prisijungdamas prie dvigrandės DNR mažosios griovelio, nes dažų prisijungimas prie dvigrandės DNR yra nespecifinis, t.
PS: Dėl savo šviesai jautrių savybių rinkoje esantys produktai paprastai supakuoti į rudus nepermatomus centrifugavimo vamzdelius (kaip parodyta paveikslėlyje žemiau).Tačiau tai susidurs su problema.Imant mėginius sunku pastebėti, ar skystis įsiurbtas.Šiuo požiūriu „Qingke“ išties yra patogiausias vartotojui (kaip parodyta paveikslėlyje žemiau), o permatomas vamzdelis supakuotas į nepermatomą skardinį maišelį.Tada įdėkite jį į skardinį maišelį, atsižvelgdami į tai, kad būtų patogu vengti šviesos ir mėginių ėmimo.Turite pasirinkti tinkamą prekės numerį.TSE204 yra itin ekonomiškas egzistavimas, todėl noriu sodinti žolę.

Labai svarbi ir fluorescencinio dažiklio koncentracija.Jei koncentracija per maža, amplifikacijos kreivė vėlesniame etape nepadidės ir nėra tobula;jei koncentracija per didelė, tai sukels triukšmo trukdžius.Kadangi fluorescencinė kiekybinė PGR daugiausia priklauso nuo KT vertės, jei fluorescencinių dažų koncentracija nėra tinkamai sureguliuota, žemiausias taškas yra geresnis nei didžiausias taškas.Žinoma, tinkama dažų koncentracija yra geriausia.

ROX: ROX dažai naudojami fluorescencinio signalo klaidoms ištaisyti.Kai kurie prietaisų gamintojai reikalauja kalibravimo, o kiti ne.Pavyzdžiui, norint naudoti „Thermo Fisher Scientific“ realaus laiko PGR stiprinimo instrumentą, paprastai reikia kalibruoti, įskaitant 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus ir kt. Bendrosiose rinkinio instrukcijose tai bus aprašyta.
Foregene qPCR Mix taip pat yra ROX dažų, kuriuos patogu naudoti įvairiuose modeliuose.

Realaus laiko PCR rinkinys-Taqman

Apdorojimas silpnu vandenilio ryšiu: Silpnų vandenilinių jungčių apdorojimas yra gana techninis dalykas.Niekas neskaitė daugelio rinkinių vadovų, tačiau nė vienas iš jų nepaminėjo šios temos.Tiesą sakant, tai labai svarbu.Bazių derinys daugiausia priklauso nuo vandenilinių jungčių stiprumo.Stiprūs vandeniliniai ryšiai yra normalus stiprinimas, o silpni vandeniliniai ryšiai sukelia nespecifinį stiprinimą.Jei silpnų vandenilio jungčių negalima gerai pašalinti, negalima išvengti nespecifinio amplifikacijos.Autoriaus nuomone, tik kelios įmonės pastebėjo šią problemą.Pirkdami rinkinį galite pasidomėti, ar šiuo klausimu svarstėte norimo pasirinkti rinkinio sprendimą.

Reakcijos tūris: 20–50 ul sistema naudojama dažniau, o mažesni kiekiai gali sukelti klaidų.Apskritai, rinkinio instrukcijose bus rekomenduojama naudoti PGR reakcijos tūrius.Nebūkite protingi ir naudokite mažesnius kiekius, kad sutaupytumėte išlaidų.tikslas.Prekybininkų rekomenduojamas tūris iš tikrųjų yra patikrintas ir gali būti, kad jie negali išspręsti mažų kiekių sukeliamų klaidų problemos.
2. Vamzdžio plokštės gamintojas ir gaminio numeris
Visi žino fluorescencinės kiekybinės PGR principą.Fluorescencinis surinkimas daugiausia atliekamas per PGR mėgintuvėlių dangtelius.Renkantis PGR eksploatacines medžiagas, atkreipkite dėmesį į du dalykus: gerą šviesos pralaidumą ir tinkamumą instrumentui.Paprastai tariant, pagrindinės prekės ženklų plokštės ir vamzdeliai yra puikūs, tačiau jūs turite atidžiai pasirinkti pritaikymą, kitaip negalėsite naudoti instrumento.

4. Aukščiausio lygio žinios

MIQE (8) – qPCR patvirtinimas
Tai yra svarbiausias qPCR prioritetas!Tiek daug herojų čia įkrito į smėlį.Žinoma, gali būti ir tai, kad tau pasisekė, o ištirti genai yra paprasti, todėl plaukiojote per ledo urvą palei vėją.qPCR patikros informacija skirta duomenų patikimumui patikrinti.Mes pateikiame reikiamą patvirtinimo informaciją taip:

1. Specifiškumo testas
Tikslinio geno amplifikacijos specifiškumas tikrinamas tikrinant, ar elektroforezės vaizdas yra viena juosta;sekos tikrinimas;lydymosi kreivė, kad pamatytumėte, ar smailių žemėlapis yra vienas;fermentų virškinimo patikrinimas ir kiti metodai.
Čia mes sutelkiame dėmesį į tnespecifinės amplifikacijos analizė naudojant lydymosi kreivių metodą.Paprastai tariant, kai projektuojame pradmenis, produkto fragmento dydis turi būti 80-200 bp diapazone, todėl PGR produkto lydymosi temperatūra yra 80-85 °C.Todėl, jei yra įvairių smailių, turi būti ir kitų nespecifinių amplifikacijos produktų;jei smailė pasirodo žemesnėje nei 80 °C temperatūroje, tai paprastai laikoma pradmenų dimeru;jei smailė pasirodo aukštesnėje nei 85°C temperatūroje, tai paprastai laikoma DNR užteršimu arba nespecifine didelių fragmentų amplifikacija.
Pastaba: kartais 80°C temperatūra būna tik viena.Šiuo metu šios koncepcijos reikia laikytis.Tikėtina, kad visi amplifikacijos rezultatai yra pradmenų dimeriai.

Normali lydymosi kreivė (viena smailė be nespecifinio stiprinimo)

Probleminė lydymosi kreivė (nespecifinis klaidingų smailių stiprinimas)
【Atvejo analizė】

Yra pagrindinė smailė, bet grunto dimeris yra rimtas
Vienos smailės lydymosi kreivė žemiau esančiame paveikslėlyje gali lengvai apgauti jūsų akis, manydama, kad tai puikus eksperimentas, tačiau rezultatas yra visiškai klaidingas.Šiuo metu turime žiūrėti į lydymosi temperatūrą.Didžiausia temperatūra yra žemesnė nei 80 ° C, o tai yra visiškai gruntas-dimeras.

Nėra tikslinio fragmento, visi pradmenų dimeriai
Štai mano brolis negali sustoti.Žemiau esančioje nuotraukoje yra nuotrauka, daryta mobiliuoju telefonu, kurį man atsiuntė niekšas.Visi jo naudojami reagentai yra pramonėje dažniausiai naudojami prekių ženklai.Jis pakeitė vieną T-prefix prekės ženklą į kitą T-prefix prekės ženklą.Manau, tu jau atspėjai.Niekšas man verkė: „Pirmoje nuotraukoje naudojamas reagentas per geras, o smailė viena.Vėliau, panaudojus jūsų rekomenduotą reagentą, atrodo kaip antrame paveikslėlyje, su mišriomis smailėmis.Tu padarei mane nelaimingą.“
Atskirkite du grafikus.Iš pirmo žvilgsnio vienas turi vieną smailę, o kitas - dvigubą.Nesąmonė, viena viršūnė, žinoma, yra gerai.Ar tai tiesa?
Blogiau nei Dou E, jei įdėsiu dvi nuotraukas žemiau esančiame paveikslėlyje, iškart suprasite.Tiesą sakant, mus lengvai paralyžiuoja toks vaizdas.Po kruopščios analizės nustatėme, kad: pirmosios figūros smailė yra 75 °C temperatūroje, o tai yra visiškai grunto dimeras;antrosios figūros pikas pasirodo esant 75°C ir 82°C, bent jau yra Produktas pasirodo.

Mokinių atsiliepimų nuotraukos
Taigi pagrindinė problema yra ne reagentų, o grunto dizaino problema.Kartu tai taip pat įrodo, kad kai kurie dideli prekių ženklai nėra geležinės kokybės, taip pat įrodo tai, ką mano brolis pasakė anksčiau: jūsų straipsnį palaiko ne reagentų prekės ženklas.Tai jūsų straipsnis, kuriame remiamas reagentų prekės ženklas.Įsivaizduokite, jei niekšas nepakeistų reagentų, į žurnalą būtų nusiųsti neteisingi duomenys, o tai, kas nutiktų, būtų tragedija.
2. Tuščio kontrolinio ruošinio Ct reikšmė
Neaiškink, jei tuščias kontrolė turi Ct reikšmę, ar tai ne tarša?Tačiau vis tiek turite suprasti, kuris tuščias valdiklis turi Ct reikšmę.Jei tai NTC, tai reiškia, kad yra svetimos DNR, pvz., užterštas reagentu.Jei tai NRT, tai reiškia, kad išskirta RNR yra užteršta DNR.
3. Standartinė kreivė
Įskaitant nuolydį ir skaičiavimo formulę, PGR efektyvumą galima apskaičiuoti pagal formulę.Tobulam eksperimentui reikia, kad standartinės kreivės nuolydis priartėtų prie 3,32, o R² – prie 0,9999.
4. Linijinis dinaminis diapazonas
Reakcijos dinaminis diapazonas yra tiesinis.Pagal šabloną, naudojamą standartinei kreivei generuoti, dinaminis diapazonas turėtų apimti bent 5 koncentracijos gradientus ir atkreipti dėmesį į Ct verčių pokyčius esant didelės koncentracijos gradientams ir mažos koncentracijos gradientams.
5. Aptikimo tikslumas
qPCR rezultatų pokyčius, ty prastą pakartojamumą, ty prastą tikslumą, lemia daugelis veiksnių, įskaitant temperatūrą, koncentraciją ir veikimą.qPCR tikslumas paprastai tampa mažiau valdomas, nes kopijų skaičius mažėja.Idealiu atveju šis techninis skirtumas turėtų skirtis nuo biologinio skirtumo, o biologiniai pakartojimai gali tiesiogiai spręsti statistinius qPCR rezultatų skirtumus tarp grupių ar gydymo būdų.Visų pirma, atliekant diagnostinius tyrimus, turi būti nurodytas geriausias tarp tyrimų tikslumas (pakartojamumas) įvairiose vietose ir operatoriuose.
6. Aptikimo efektyvumas ir LOD (daugybiniame qPCR)
LOD yra mažiausia 95 % aptiktų teigiamų mėginių koncentracija.Kitaip tariant, tikslinių genų replikacijų rinkinyje esanti LOD koncentracija neturėtų viršyti 5% nepavykusių reakcijų.Atliekant multipleksinę qPCR analizę, ypač vienu metu nustatant taškines mutacijas ar polimorfizmus, daugialypė qPCR turi pateikti įrodymų, kad kelių tikslinių fragmentų tikslumas nepakenks tame pačiame mėgintuvėlyje, kelių aptikimo ir vieno mėgintuvėlio aptikimo efektyvumas ir LOD turi būti vienodi.Ypač kai tuo pačiu metu amplifikuojami didelės koncentracijos tiksliniai genai ir mažos koncentracijos tiksliniai genai, į šią problemą reikia atkreipti dėmesį.
Problemos ir sprendimaiPaprastai kalbant, problemos, su kuriomis dažnai susiduriama atliekant qPCR derinimą, yra sutelktos į šiuos aspektus:
·nespecifinis stiprinimas
·Sudėtingas grunto koncentracijos pasirinkimas ir bėdos su gruntu-dimeriais
· Netiksli atkaitinimo temperatūra
·Antrinė struktūra turi įtakos stiprinimo efektyvumui
nespecifinis stiprinimas
nespecifinis stiprinimasįvyksta , paprastai svarstoma, ar grunto konstrukcija netinka, tačiau jei neskubate keisti gruntų, pirmiausia galite išbandyti šiuos būdus (principas taip pat pridedamas):
·Padidinkite atkaitinimo temperatūrą – stenkitės, kad silpni vandeniliniai ryšiai neišsilaikytų;
·Sutrumpinkite atkaitinimo ir pailgėjimo laiką – sumažinkite silpnų vandenilinių jungčių tikimybę;
·Sumažinti pradmenų koncentraciją – sumažinti perteklinių pradmenų ir netikslinių regionų prisijungimo tikimybę;
Žemas stiprinimo efektyvumas
Priešinga situacija nespecifiniam stiprinimui - mažas stiprinimo efektyvumas, o priemonės, skirtos mažam stiprinimo efektyvumui kovoti, yra priešingos:
· Pailginti atkaitinimo ir pailgėjimo laiką;
· Pakeiskite į trijų pakopų PGR ir sumažinkite atkaitinimo temperatūrą;
·Padidinti grunto koncentraciją;
Ps: Daugelis devintajame dešimtmetyje gimusių absolventų nenori mokytis, kaip derinti eksperimentus, ir tikisi, kad rinkinys gali visiškai išspręsti problemą (jei baigę studijas norite eiti į reagentų įmonę atlikti tyrimų ir plėtros), tiesą sakant, reagentų gamintojai taip pat galvoja taip, tikiuosi, tai kvaila. Jį galima naudoti, kai jį gausite, taigi, daug reagentų gamintojų pastangų reikia išspręsti nespecifiškai. -ryšių sugerties faktoriai.Kad nesunkiai išspręstų problemą, kvailiai vis tiek turi perskaityti reagentų įmonės įvadą, kad pamatytų, ar nėra veiksnio, kuris sugeria silpnas vandenilines jungtis.
Sunkus grunto koncentracijos pasirinkimas ir bėdos su gruntu-dimeriais
1 būdas: Apskritai, qPCR rinkinio instrukcijose yra rekomenduojamos sistemos ir rekomenduojamos pradmenų koncentracijos.
2 būdas: Derinimas nustatant pradmenų koncentracijos gradientą.Žemiau esanti nuotrauka pavogta iš įmonės, kad būtų parodyta.Žemiau esančiame paveikslėlyje parodyti kiekybiniai fluorescencijos rezultatai, gauti naudojant tris pradmenų koncentracijos gradientus (100 nM, 250 nM, 500 nM) ir keturis šablono koncentracijos gradientus (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Eksperimento rezultatų Ct vertė vaizduojama taip:

Pradmenų koncentracijos pasirinkimas Sujunkite kiekvieną pradmenų koncentraciją į liniją taip:

Pradmenų koncentracijos pasirinkimas yra akivaizdus, ​​tiesinis 100 nM ir 250 nM pradmenų koncentracijos ryšys yra geresnis, o 500 nM pradmenų koncentracijos tiesinis ryšys yra gana prastas.100 nM ir 250 nM Ct reikšmė 250 nM yra santykinai maža, todėl optimali pradmenų koncentracija yra 250 nM.Paprastai lydymosi kreivėje gali būti matomi stiprūs pradmenų dimeriai.Ką daryti, jei sukurti gruntai negali išvengti pradmenų-dimerų?
3 būdas: Sumažinkite pradmenų kiekį ir padidinkite atkaitinimo temperatūrą (aiškinti nereikia).
Empirinė atkaitinimo temperatūros vertė yra 60°C.Jei nesate tikri, kaip pasirinkti tinkamesnę atkaitinimo temperatūrą?Atsakymas yra toks pat kaip ir pasirinkus grunto koncentraciją –gradiento testas.Norėdami iliustruoti problemą, nufotografuokite „Bio-rad“ įmonę.Norėdami sustiprinti tam tikrą tikslinį fragmentą, nustatykite aštuonis temperatūros gradientus, kiekvienas su trimis pakartojimais, ir gauta amplifikacijos kreivė yra tokia:

Atkaitinimo temperatūros pasirinkimas:
·70°C, 69°C – iš esmės pradmenų negalima derinti, todėl nėra stiprinimo.
·67,3°C – pradžioje yra nedidelis stiprinimas, o Ct reikšmė yra santykinai didelė.
·64,5°C – Ct reikšmė mažėja.
· Esant 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C ir 55,0 °C, Ct vertės iš esmės buvo stabilios, tačiau galutinės fluorescencijos vertės skyrėsi.
Kaip išsirinkti?Principas: pirmasis principas yra didesnė Ct vertė.Norėdami tai padaryti, pasirinkite aukštesnę atkaitinimo temperatūrą, kad išvengtumėte dimerizacijos ir nespecifinio amplifikacijos.Nors 55 °C temperatūroje yra didesnė fluorescencijos reikšmė, joje gali būti dimerų arba nespecifinio amplifikacijos.
Bet jei esate toks protingas kaip jūs, tikrai pagalvosite: logiškai mąstant, jei PGR reakcija yra labai specifinė, kol pradmenų koncentracija viršija minimalų reikalavimą, aukšti ir žemi taškai neturėtų turėti jokios įtakos, kaip ir fluorescenciniai dažai ir dNTP.Iš tiesų, tol, kol atkaitinimo temperatūra bus tinkamai optimizuota, pradmenų koncentracijos poveikis Ct vertei natūraliai bus sumažintas.

Atkaitinimo temperatūra yra tinkamai optimizuota, o pradmenų koncentracijos poveikis KT bus sumažintas
Antrinė struktūra turi įtakos stiprinimo efektyvumui
Norėdami iliustruoti problemą, paimkime nuotrauką iš Bio-rad.Jis taip pat sukuria temperatūros gradientą, kad sustiprintų antrinės struktūros geną.

Atsiranda antrinė struktūra
Matyti, kad mažėjant temperatūros gradientui pradeda atsirasti produktai ir Ct reikšmė juda į priekį, pasiekdama mažiausią reikšmę esant 60,7°C, o vėliau temperatūros gradientui mažėjant Ct reikšmė tampa didesnė.Ir atvirkščiai, kylant temperatūrai, antrinė struktūra atsiveria ir stiprinimo efektyvumas didėja.Pasiekus tam tikrą temperatūrą, temperatūros padidinimas negali pagerinti stiprinimo efektyvumo.Kadangi šiuo metu gruntai negali būti stabiliai derinami.Todėl,ieškokite temperatūros su mažiausia Ct verte, kuri yra geriausia temperatūra antrinės struktūros šablonui sustiprinti!Žinoma, protingi kvailiai turi žinoti, kad jei tai nėra būtina, geriausia keisti pradmenis ir vengti antrinės struktūros regiono.
5. Taikymo lygis
MIQE – duomenų analizė

Duomenų analizė daugiausia atliekama naudojant fluorescencinę kiekybinę PGR priemonę.Ankstesniame straipsnyje buvo atlikta daug duomenų analizės darbų, pvz., tuščia kontrolė, kuri buvo paaiškinta kuriant eksperimentą.Išaiškinti vidiniai etaloniniai genai, pasikartojimo skaičiai ir kt., čia mes daugiausia paaiškiname qPCR taikymą.
qPCR yra plačiai naudojamas, o eksperimentinis patikrinimas ir nukleorūgščių diagnostika yra dažniausiai naudojami scenarijai.
absoliutus kiekybinis įvertinimas
Log (pradinė koncentracija) turi tiesinį ryšį su ciklų skaičiumi.Iš standarto su žinomu pradiniu kopijos numeriu galima nubrėžti standartinę kreivę, tai yra, galima gauti tiesinį amplifikacijos reakcijos ryšį.Pagal mėginio Ct reikšmę galima apskaičiuoti koncentraciją mėginyje.Įtrauktinų šablonų kiekis.

Absoliutaus kiekybinio skaičiavimo metodas
Absoliutus kiekybinis įvertinimas turi būti pagrįstas standartine kreive.Norint sudaryti standartinę kreivę, reikalingas standartas.Paprastai standartas yra plazmidė, gauta klonuojant tikslinį geną.Kodėl tai plazmidė?Kadangi žiedinė plazmidinė DNR yra pati stabiliausia.Standartinį produktą praskieskite 5–6 gradientais pagal padvigubinimo santykį (10 kartų praskiedimas), o skiedimo metu atkreipkite dėmesį į vienodumą.Tegul Ct vertė nukrenta tarp 15-30.

Standartinis paruošimas
Tuo pačiu metu tiriamas mėginys taip pat turi būti atitinkamai atskiestas (atminkite praskiedimo koeficientą), o Ct vertė taip pat turėtų būti 15–30.Standartinis gaminys + bandomasis pavyzdys dedami ant mašinos kartu.Po bandymo buvo sudaryta standartinė kreivė su standartine medžiaga, o tirti mėginiai buvo įtraukti į standartinę kreivę, kad būtų apskaičiuota koncentracija.
Hepatito B viruso HBV kiekybinis nustatymas yra tipiškas absoliutus kiekybinis įvertinimas, pagal kurį galima apskaičiuoti viruso kopijų skaičių 1 ml kraujo.
Kopijos numerio apskaičiavimas
Mėginio koncentracija, kurią reikia ištirti (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × praskiedimo koeficientas
Mėginio molekulinė masė = bazių skaičius × 324
Tiriamo mėginio kopijos numeris (kopijos/ul) = tiriamo mėginio koncentracija / mėginio molekulinė masė × 6 × 1014

Kopijos numerio apskaičiavimo metodas

Aukščiau pateiktas skaičiavimo metodas kiekiui nustatyti.Tai matematinė problema, kurią galima išspręsti baigus vidurinę mokyklą, o matematines problemas dažniausiai sprendžia kompiuteriai.Jei nesupranti, gali ateiti pabendrauti.
santykinis kiekybinis įvertinimas
Santykinis kiekybinis įvertinimas daugiausia naudojamas moksliniuose tyrimuose.Kiek virusų yra 1 ml kraujo, ir tai yra DNR virusas, tai gana deterministinis įvykis: galima nustatyti kraujo kiekį, o DNR virusas yra gana stabilus.Tačiau mums sunku palyginti tam tikro geno transkripcijos kopijų skaičių lape, nes sunku nustatyti lapo dydį, svorį ir švelnumą, sunku nustatyti išskirtos RNR kiekį, taip pat sunku nustatyti atvirkštinės transkripcijos efektyvumą, t.
Todėl santykinis kiekybinis įvertinimas turi įtraukti elementą:vidinis atskaitos genas.
Kitaip tariant, santykinis kiekybinis nustatymas iš tikrųjų yra tikslinio geno ir vidinio etaloninio geno palyginimas.Palyginti tame pačiame audinyje ir toje pačioje ląstelėje, mėginio dydžio, RNR ekstrahavimo kiekio, atvirkštinės transkripcijos efektyvumo ir PGR efektyvumo įtaka yra palyginti nedidelė.Dėl mažo imties dydžio tiek vidiniai etaloniniai genai, tiek tiksliniai genai buvo santykinai sumažinti.Štai kodėl anksčiau akcentavome vienodumą ir stabilumą.
Vidiniai atskaitos genai paprastai yranamų tvarkymo genai(namų priežiūros genai), kurie nurodo genų, kurie stabiliai ekspresuojami visose ląstelėse, klasę, o jų produktai yra būtini norint palaikyti pagrindinę ląstelių gyvybinę veiklą.
Nepainiokite šios sąvokos.Namų tvarkymo genai yra biologinės funkcijos terminai, o vidiniai etaloniniai genai yra eksperimentiniai techniniai terminai.Namų tvarkymo genai turi būti patvirtinti, kad būtų galima pasirinkti kaip vidinius etaloninius genus.
Pavyzdžiui, žemiau esančiame paveikslėlyje pasirinkome kelis namų ruošos genus, kad išbandytume jų ekspresijos lygius skirtingose ​​audinių ląstelėse, ir nustatėme, kad β-2-mikroglobulino ekspresijos lygiai labai skiriasi nuo kitų trijų genų, todėl jie negalėjo būti naudojami kaip vidiniai etaloniniai genai.

Suvokus vidinio etaloninio geno korekcijos funkciją, dėl vidinio etaloninio geno įvedimo išvedami du algoritmai.
·dvigubos standartinės kreivės metodas
·2 – △△Ct metodas (KT vertės palyginimo metodas)
Jei jus domina rūšių ir genų funkcijų tyrimas, atsisakykite algoritmų tyrimų ir naudokite formules tiesiogiai arba naudokite mašinas tiesiogiai;jei esate tiesus matematikos ir inžinerijos vaikinas, nedvejodami.
dvigubo standarto kreivės metodas
Pagal standartinę kreivę įvertinkite kontrolinio mėginio ir bandinio, kurį reikia tirti, tikslinį geną ir namų tvarkymo geną, o tada apskaičiuokite santykinę vertę pagal skaičiavimo formulę, kuri yra santykinis ekspresijos lygis.
Privalumai: paprasta analizė, palyginti paprastas eksperimentinis optimizavimas
Trūkumas: kiekvienam genui kiekvienas eksperimentų etapas turi sudaryti standartinę kreivę
Taikymas: vienas iš dviejų dažniausiai naudojamų ir pripažintų santykinių kiekybinių metodų tiriant genų ekspresijos reguliavimą
Formulė yra tokia:

Pavyzdžiai yra tokie:

Apskaičiuokite santykinį kiekį pagal kiekybinį rezultatą
2 – △△Ct metodas (KT vertės palyginimo metodas)

Privalumai: Nereikia daryti standartinės kreivės
Trūkumai: Daroma prielaida, kad stiprinimo efektyvumas yra artimas 100 %;standartinis nuokrypis yra < 5 %, o standartinė kreivė ir efektyvumas tarp kiekvieno stiprinimo yra nuoseklūs;eksperimentinių sąlygų optimizavimas yra sudėtingesnis.
Taikymas: vienas iš dviejų dažniausiai naudojamų ir pripažintų santykinių kiekybinių metodų tiriant genų ekspresijos reguliavimą

Žinoma, amplifikacijos efektyvumas paprastai negali būti idealus 1. Koregavimo metodas: Jei žinome, kad tikslinio geno ir etaloninio geno amplifikacijos efektyvumas yra toks pat, bet amplifikacijos efektyvumas nėra lygus 1, tada 2－△△Ct galima pakoreguoti taip: (1+E )－△△, tada efektyvumas yra teisingas, pavyzdžiui, amplifikacija yra 0.9.9. 1,95 －△△ Ct
Iki šiol turinys apie fluorescencinę kiekybinę PGR baigėsi.